金齊穎，吳紅芳，張園園，馬原源，鄧春穎，劉 昊

目前，全球抑郁癥患者約有三億五千萬，是導(dǎo)致自殺、殘疾和疾病負(fù)擔(dān)的重要原因[1]，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。海馬是參與學(xué)習(xí)、記憶及情緒調(diào)節(jié)的重要邊緣系統(tǒng)腦區(qū)，其改變在各種應(yīng)激疾病中起到關(guān)鍵作用。研究[2-3]顯示，抑郁癥大鼠和抑郁癥患者海馬部位均存在明顯的萎縮。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量最多，人們認(rèn)識(shí)到其作用不僅僅是營養(yǎng)、支持等輔助作用，還參與腦的高級(jí)功能活動(dòng)，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)必不可少的組成部分[4]。膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)能夠用來特異性標(biāo)記成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞，被廣泛應(yīng)用于抑郁癥發(fā)病機(jī)制的研究中[5]。研究[6]表明抑郁大鼠海馬神經(jīng)元存在凋亡，然而，海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞是否存在凋亡現(xiàn)象，目前尚未見報(bào)道。該實(shí)驗(yàn)建立慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激(chronic unpredicted mild stress，CUMS)模型，檢測海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞是否存在凋亡，探究抑郁癥發(fā)病過程中海馬體積異常的原因。

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成年雄性SD大鼠90只，清潔級(jí)，體質(zhì)量180～200 g，華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。飼養(yǎng)條件：22～25 ℃，3～5只每籠，晝夜節(jié)律(12 h/12 h)，自由飲水進(jìn)食。

1.2主要試劑GFAP、小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體、驢抗羊熒光二抗、驢抗兔熒光二抗、兔抗小鼠單克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司；兔抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cysteine-containing aspartate-specific proteases-3，Caspase-3)多克隆抗體、兔抗Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)多克隆抗體、兔抗B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymmpoma/leukemia-2，Bcl-2)多克隆抗體、羊抗兔單克隆抗體購自美國ProteinTech公司；Western blot和免疫熒光相關(guān)試劑購自武漢博士德生物有限公司。

1.3方法

1.3.1動(dòng)物分組及模型建立 按照隨機(jī)數(shù)字表法將90只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(45只)和模型組(45只)，模型制備成功后又隨機(jī)分為1、7、14 d 3個(gè)亞組(每組15只)。模型組給予CUMS。應(yīng)激包括11種：4 ℃冰水游泳5 min，鼠籠45°傾斜24 h，禁食24 h，42 ℃熱水游泳5 min，束縛2 h，潮濕墊料24 h，夾尾90 s，禁水24 h，雙耳電擊5 s兩次(0.8 mA)，鼠籠搖動(dòng)15 min，持續(xù)光照24 h。在28 d內(nèi)每天隨機(jī)給予一種刺激，同種刺激不連續(xù)出現(xiàn)。對(duì)照組大鼠除每天抓取一次外，不做任何特殊處理。在應(yīng)激結(jié)束后，分別于1、7、14 d處死大鼠。

1.3.2行為學(xué)檢測

1.3.2.1糖水偏好實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前大鼠進(jìn)行禁食水24 h，每個(gè)鼠籠放置兩個(gè)完全相同的水瓶，純凈水和1%的蔗糖水各200 ml，雙瓶共飲，實(shí)驗(yàn)前確保飲水瓶不滴漏。測量1 h內(nèi)純凈水和蔗糖水的消耗量。計(jì)算糖水偏好率：糖水偏好率(%)=糖水消耗量/總液體消耗量×100%。

1.3.2.2曠場實(shí)驗(yàn) 造模結(jié)束后，在每天相同的時(shí)間段將大鼠放在長120 cm、寬120 cm、高35 cm的場所的中心方格中，運(yùn)用鼠博士視頻分析系統(tǒng)記錄，包括5 min內(nèi)大鼠行走總路程，中央活動(dòng)時(shí)間，站立次數(shù)，修飾行為等。

1.3.2.3Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 連續(xù)3 d記錄大鼠在120 s內(nèi)找到水下平臺(tái)需要的時(shí)間，即逃避潛伏期(escape latent，EL)，最后用Morris水迷宮軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.3.3Western blot法檢測海馬Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白的表達(dá) 將大鼠麻醉后斷頭取腦，冰上快速分離海馬，提取組織總蛋白。BCA定量后按照30 μg蛋白量上樣，進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳，PVDF膜電轉(zhuǎn)印，脫脂奶粉封閉，一抗兔抗Caspase-3多克隆抗體(1 ∶500)、兔抗Bax多克隆抗體(1 ∶500)，兔抗Bcl-2多克隆抗體(1 ∶500)及小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體(1 ∶5 000),4 ℃孵育過夜，二抗羊抗兔IgG(1 ∶5 000)室溫孵育1 h，ECL顯色。同樣的方法進(jìn)行內(nèi)參β-actin的Western blot分析。以目的條帶與內(nèi)參的光密度比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4免疫熒光雙標(biāo) 大鼠麻醉后，進(jìn)行灌流固定，取腦組織，常規(guī)制作石蠟切片。切片脫蠟至水，抗原修復(fù)后，免疫組化筆劃圈，0.4% PBS-Triton室溫孵育15 min，驢血清封閉1 h，加入一抗(兔抗Caspase-3多克隆抗體與羊抗GFAP混合液、或兔抗Bax多克隆抗體與羊抗GFAP一抗混合液、或兔抗Bcl-2多克隆抗體與羊抗GFAP一抗混合液)，4 ℃孵育過夜，陰性對(duì)照用PBS代替一抗，次日室溫孵育45 min，加入Alexa Fluor594標(biāo)記的驢抗兔二抗和Alexa Fluor488標(biāo)記的驢抗羊二抗混合液，封片劑封片，放置于避光盒內(nèi)，激光共聚焦顯微鏡觀察攝片。

2 結(jié)果

2.1糖水偏好實(shí)驗(yàn)對(duì)照組與模型組的普通水消耗量兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對(duì)照組和模型組大鼠糖水偏好率兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。模型組大鼠糖水消耗量和糖水偏好率低于對(duì)照組。見表1。

表1 兩組大鼠糖水偏好結(jié)果

與對(duì)照組比較：**P<0.01

圖1 兩組大鼠曠場實(shí)驗(yàn)和Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)軌跡圖

A：對(duì)照組曠場實(shí)驗(yàn)軌跡圖；B：模型組曠場實(shí)驗(yàn)軌跡圖；C：對(duì)照組Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)軌跡圖；D：模型組Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)軌跡圖

表2 兩組大鼠曠場實(shí)驗(yàn)和 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與對(duì)照組比較：**P<0.01

2.2曠場實(shí)驗(yàn)和水迷宮實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠行走總路程、中央活動(dòng)時(shí)間、直立次數(shù)、和修飾行為次數(shù)均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。模型組大鼠平均逃避潛伏期較對(duì)照組明顯延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2、圖1。

2.3各組大鼠海馬Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達(dá)情況根據(jù)條帶分析顯示，與對(duì)照組比較，CUMS后1、7、14 d大鼠海馬Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平均升高(P<0.05)，7 d時(shí)升高最明顯。與對(duì)照組比較，CUMS后1、7、14 d大鼠海馬Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。模型組大鼠Bax/Bcl-2較對(duì)照組升高(P<0.05)。結(jié)果見圖2、表3。

圖2 Western blot法檢測海馬Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達(dá)

組別BaxBcl-2Caspase-3Bax/Bcl-2對(duì)照0.63±0.121.05±0.150.55±0.120.60±0.04CUMS 1 d0.95±0.17?1.02±0.16?0.99±0.22?0.93±0.03? 7 d1.38±0.30?0.89±0.16?1.59±0.40?1.54±0.99? 14 d0.92±0.25?0.45±0.07?0.86±0.15?2.07±0.42?F值13.6927.3822.1965.01

與對(duì)照組比較：*P<0.05

2.4免疫熒光雙標(biāo)GFAP為Alexa Fluor488激發(fā)的綠色熒光，Bax、Bcl-2和Caspase-3均為Alexa Fluor594激發(fā)的紅色熒光，圖像融合后可見黃色熒光，表明GFAP 和Bax、GFAP和Bcl-2、GFAP和 Caspase-3均有共定位表達(dá)。CUMS后7 d模型組大鼠海馬Bax陽性細(xì)胞及熒光融合均多于對(duì)照組，見圖3。CUMS后7 d模型組大鼠海馬Bcl-2陽性細(xì)胞及熒光融合均少于對(duì)照組，見圖4。CUMS后7 d模型組大鼠海馬Caspase-3陽性細(xì)胞及熒光融合均多于對(duì)照組，見圖5。

3 討論

抑郁癥是一種常見的神經(jīng)精神疾病，主要表現(xiàn)為持續(xù)的情緒低落、無價(jià)值感、認(rèn)知功能的改變等，嚴(yán)重時(shí)常伴有自殺傾向[7]，目前病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。建立正確的抑郁癥動(dòng)物模型是抑郁癥實(shí)驗(yàn)研究成功的關(guān)鍵。相關(guān)資料表明，大鼠的壽命約為2～3年，大鼠經(jīng)歷7 d約為人類的1年[8]，通過給予模型組大鼠CUMS刺激，可以模擬人們現(xiàn)實(shí)生活中經(jīng)受的慢性、間斷性、低強(qiáng)度的刺激后出現(xiàn)的癥狀[9]。本實(shí)驗(yàn)行為學(xué)檢測結(jié)果表明，模型組大鼠糖水消耗量和糖水偏好百分比明顯降低，曠場實(shí)驗(yàn)得分明顯減低，逃避潛伏期明顯延長，提示經(jīng)過CUMS刺激后，大鼠表現(xiàn)出明顯的快感缺失、自主探究行為減少、探索能力下降、空間學(xué)習(xí)記憶能力減退，成功地模擬了抑郁癥患者的主要癥狀。本實(shí)驗(yàn)選取CUMS后1、7、14 d模擬人類患抑郁癥后1、2、3年后凋亡相關(guān)因子的變化，為抑郁癥的治療提供新的理論依據(jù)。

圖3 免疫熒光雙標(biāo)法檢測大鼠海馬組織中Bax的表達(dá) ×400

圖4 免疫熒光雙標(biāo)法檢測大鼠海馬組織中Bcl-2的表達(dá) ×400

圖5 免疫熒光雙標(biāo)法檢測大鼠海馬組織中Caspase-3的表達(dá) ×400

本課題組前期對(duì)抑郁癥大鼠海馬體積縮小的原因進(jìn)行研究[10-12]顯示，海馬神經(jīng)元存在明顯的凋亡、自噬及神經(jīng)可塑性等改變。星形膠質(zhì)細(xì)胞廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，在神經(jīng)元營養(yǎng)支持、神經(jīng)組織的修復(fù)及再生、血腦屏障的形成及維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定、神經(jīng)遞質(zhì)的攝取、突觸的傳遞、神經(jīng)免疫等方面起著十分重要的作用[13-14]。GFAP是特異性表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞的一種III型中間絲蛋白，分子量為50～52 ku，GFAP基因位于17號(hào)染色體上(17q21)，其表達(dá)水平與星形膠質(zhì)細(xì)胞活化呈正比，是星形膠質(zhì)細(xì)胞公認(rèn)的標(biāo)志性蛋白，可能與其特異性的末端氨基酸序列有關(guān)[15-16]，因此本實(shí)驗(yàn)采用免疫熒光標(biāo)記的方法檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)情況。

細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，細(xì)胞在多種因素作用下發(fā)生的自主性、程序性的細(xì)胞死亡方式，受到凋亡調(diào)控蛋白調(diào)控。Bax為Bcl-2家族的促凋亡基因，Bax為胞漿蛋白，自身可形成同源二聚體，當(dāng)細(xì)胞受到刺激時(shí)破壞線粒體外膜，使其通透性增大，幫助細(xì)胞色素C穿過線粒體膜，激活Caspase-9，進(jìn)而激活Caspase-3，加速細(xì)胞凋亡。Bcl-2為Bcl-2家族的抑凋亡基因，Bcl-2通過抑制促凋亡蛋白的釋放、抑制Caspase激活，穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)Ga2+、抗氧化、抑制Bax的細(xì)胞毒性等機(jī)制發(fā)揮作用。Bax/Bcl-2的比值決定了細(xì)胞的生存和死亡。Caspase-3是細(xì)胞凋亡最關(guān)鍵的效應(yīng)蛋白酶，是多種凋亡刺激信號(hào)的最終匯集點(diǎn)，被稱為“細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者”[17-18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠海馬中Bax表達(dá)上升，Bcl-2表達(dá)下降，Bax/Bcl-2比值上升，說明CUMS能夠上調(diào)促凋亡蛋白Bax水平，下調(diào)抑凋亡蛋白Bcl-2水平，提高Bax/Bcl-2比值，能夠有效促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致海馬體積萎縮，促使大鼠表現(xiàn)出抑郁狀態(tài)。

本研究顯示，對(duì)照組和模型組GFAP和Bax、GFAP和Caspase-3均可見共定位表達(dá)，模型組較對(duì)照組二者融合更廣泛。同樣，對(duì)照組和模型組GFAP和Bcl-2也可見共定位表達(dá)，但模型組二者融合明顯少于對(duì)照組。表明抑郁大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡增加，可能參與了抑郁癥大鼠海馬體積的萎縮。然而細(xì)胞凋亡存在3種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，受多種基因調(diào)控，本實(shí)驗(yàn)僅探討了凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3的表達(dá)變化情況，更多的凋亡機(jī)制及抑郁癥患者海馬體積異常的原因有待更深入的研究。