宋 陽，李 俊, 解 丹，周德喜，林 珍

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)其主要病理特征是關(guān)節(jié)滑膜的慢性、進行性、侵襲性炎癥，促使血管翳的形成以及軟骨與骨組織的破壞，致關(guān)節(jié)病變，是人類致殘的主要原因之一。作為炎癥相關(guān)性疾病，RA發(fā)病機制還未完全闡明，研究[1]報道RA發(fā)病過程中，炎性細胞包括腹腔巨噬細胞(peritoneal macrophages, PMΦ)的激活，引起細胞因子分泌不平衡，如白細胞介素-1(interleukin-1)、 IL-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)明顯增多，IL-10顯著減少，是RA形成的主要機制之一。 Xie et al[2]研究報道，IL-10可抑制單核巨噬細胞的激活、相關(guān)炎癥因子的合成、分泌，減輕全身及關(guān)節(jié)局部炎癥反應(yīng)。但在RA發(fā)病過程中IL-10分泌減少機制尚不清楚。Karouzakis et al[3]研究RA患者的滑膜細胞發(fā)現(xiàn)，基因啟動子甲基化異常參與了RA的病程。Cifuentes-Zuniga et al[4]研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞中IL-10的表達變化可能與DNMT密切相關(guān)。上述研究提示，DNMT促進IL-10甲基化沉默，可能是RA發(fā)病機制之一。該實驗以完全弗氏佐劑(complete Freund adjuvant，CFA)誘導(dǎo)大鼠 PMΦ為研究對象，探討IL-10表達降低的可能機制，為RA防治提供思路。

1 材料與方法

1.1實驗動物Sprague Dawley (SD)大鼠，安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，清潔級，雌性，體質(zhì)量 (230±20)g，動物合格證號：皖醫(yī)實動準字01號。動物飼養(yǎng)環(huán)境模擬自然晝夜條件，自由飲水、進食，室溫18～22 ℃，濕度40%～60%。

1.2主要藥物與試劑CFA、5-氮雜胞苷(5-azaC)、脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)購自美國Sigma公司；IL-10、甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)、β-actin引物序列由中國上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；甲基化特異性PCR(MSP)引物序列由中國上海希匹吉生物工程公司合成；MSP轉(zhuǎn)化試劑盒購自德國QIAGEN公司；DNMT1、β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司；辣根酶兔抗山羊IgG(H+L)、辣根酶山羊抗小鼠IgG(H+L)購自北京中杉公司。

1.3實驗方法

1.3.1佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)模型大鼠建立 SD大鼠使用足趾容積儀測定左、右后踝關(guān)節(jié)以下容積(ml)后，隨機分為正常組、模型組。模型組使用CFA(0.1 ml)注射于左后足趾皮內(nèi)，正常組注射相同劑量PBS。

1.3.2AA模型大鼠鑒定

1.3.2.1足爪腫脹度變化的測定 致炎第17天、第21天、第24天、第28天后，檢測繼發(fā)側(cè)大鼠關(guān)節(jié)足腫脹度程度(Δml=致炎后容積-致炎前容積)。

1.3.2.2多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)(polyarthritis index，PI)評分 記錄第17天、第21天、第24天、第28天大鼠全身關(guān)節(jié)病變程度，按5級評分法計算PI。0：無變化；1：足小趾關(guān)節(jié)紅腫；2：趾關(guān)節(jié)、足跖出現(xiàn)紅腫；3：踝關(guān)節(jié)以下出現(xiàn)紅腫；4：包括踝關(guān)節(jié)均呈現(xiàn)紅腫狀態(tài)。根據(jù)大鼠關(guān)節(jié)紅腫程度(不包括左后足)累計積分，計算出各只大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分。

1.3.2.3大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織病理檢查 注射CFA 28 d后，取大鼠膝關(guān)節(jié)進行常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色觀察。

1.3.3PMΦ的提取 大鼠常規(guī)麻醉后，股動脈放血法處死，用新潔爾滅溶液浸泡消毒5 min，腹腔注射PBS(10 ml，4 ℃)，仰臥、平放、輕揉大鼠腹部。靜置5 min后吸取腹腔中液體。4 ℃、1 000 r/min 離心10 min，棄上清液； PBS清洗， DMED培養(yǎng)液重懸，加入6孔板，每孔1 ml(2×106/ml)，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，棄上清液，PBS清洗，巨噬細胞為貼壁細胞。

1.3.45-azaC作用濃度與時間的確 將正常組與模型組細胞接種于24孔板后，進行細胞實驗分組。正常組：對照組大鼠PMΦ，加無血清培養(yǎng)基；模型組：AA大鼠PMΦ加LPS(2 μg/ml)刺激；5-azaC作用模型組細胞24 h與48 h濃度梯度組：AA大鼠PMΦ加LPS(2 μg/ml)刺激，同時給予5-azaC(1、5、10 μmol/L)作用24 h與48 h；體積(1 ml/孔)，平行孔(3個/組)，ELISA法檢測各組細胞上清液IL-10的表達，分析5-azaC作用的最佳濃度和時間。

1.3.5RT-PCR法分析大鼠PMΦ中IL-10、DNMT1 基因表達情況 TRIzol法提取各組細胞總RNA，參照試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，引物序列見表1。PCR反應(yīng)產(chǎn)物由1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，各擴增產(chǎn)物對β-actin光密度值的比值表示目的基因的相對表達量。

1.3.6Western blot法檢測DNMT1蛋白水平 各瓶細胞加入含PMSF的細胞裂解液400 μl于冰上裂解30 min，后4 ℃、12 000 r/min 離心30 min。BCA法測定蛋白濃度，以含30 μg 蛋白的溶液體積為上樣量(濃縮膠電泳80 V，分離膠電泳120 V)，轉(zhuǎn)膜250 mA，4 h，封閉，漂洗后加入一抗，4 ℃過夜，加入二抗， 60 min輕搖，顯影，分析條帶吸光值(以β-actin為內(nèi)參)。

1.3.7MSP檢測IL-10啟動子區(qū)甲基化狀態(tài) 按試劑盒說明提取DNA，亞硫酸氫鈉處理，進行MSP檢測，引物序列見表2。1.5%瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物混合上樣緩沖液(恒壓160 V、60 min)，凝膠圖像分析系統(tǒng)進行圖像分析。

表1 引物序列和PCR產(chǎn)物長度

表2 MSP引物序列和產(chǎn)物長度

2 結(jié)果

2.1AA模型大鼠的建立及評價

2.1.1AA模型大鼠整體評價 正常組大鼠四肢狀態(tài)正常，食飲如常，皮毛光澤。模型組大鼠體重降低，因關(guān)節(jié)紅腫不便爬行，輕度脫毛且毛色黯淡無光。注射CFA后第14天，觀察到關(guān)節(jié)紅腫，部分大鼠耳、尾可見炎性結(jié)節(jié)和紅斑；第17天，部分大鼠關(guān)節(jié)負重能力減弱；第24天～第28天左右，部分大鼠關(guān)節(jié)出現(xiàn)畸形，嚴重影響四肢活動及進食，關(guān)節(jié)炎腫脹達到高峰。

2.1.2AA模型大鼠繼發(fā)性足腫脹變化 大鼠造模第17天后，可見關(guān)節(jié)腫脹度顯著增加，并日趨嚴重，在第28天腫脹最為顯著，與正常組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(表3)。

表3 大鼠足腫脹度變化情況

與正常組比較：**P<0.01

2.1.3AA大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎足爪評分 造模第17天后，實驗通過多發(fā)性關(guān)節(jié)炎足爪評分顯示， AA模型大鼠未注射CFA的其余3個肢體關(guān)節(jié)，出現(xiàn)了紅腫、變形、行動不便；第28天達到最高峰，結(jié)果見圖1。后期實驗以造模28 d為研究對象。

2.1.4AA模型大鼠膝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)檢查 病理檢查顯示，正常組大鼠關(guān)節(jié)囊滑膜細胞有2～3層，且細胞排列規(guī)則，未見滑膜組織增生和形成的血管翳 (圖2A)。與正常大鼠比較，模型組大鼠發(fā)生炎性細胞浸潤，可見滑膜層變厚，與滑膜細胞呈乳頭狀突起增生，且細胞排列紊亂有關(guān)，亦可見滑膜下層纖維組織增生，血管翳形成 (圖2B、2C)。

圖1 大鼠PI評分

2.2AA模型大鼠PMΦ中IL-10表達的變化及機制

2.2.15-azaC對AA模型大鼠PMΦ分泌IL-10的影響 ELISA檢測顯示，與正常組PMΦ分泌IL-10比較，AA組PMΦ IL-10含量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與AA組比較，用濃度分別為1、5、10 μmol/L的5-azaC刺激AA組PMΦ細胞24 h和48 h，可不同程度提高IL-10的含量；5 μmol/L作用48 h促進IL-10升高最為顯著(P<0.01)(表4)。5 μmol/L、48 h作為后期實驗濃度和時間。

圖2 大鼠膝關(guān)節(jié)組織學(xué)檢查 ×10

圖3 RT-PCR法檢測AA大鼠PMΦ中IL-10基因表達情況

圖4 MSP法分析AA大鼠PMΦ中IL-10啟動子甲基化狀態(tài)

圖5 RT-PCR法檢測AA大鼠PMΦ中DNMT1基因表達情況

2.2.25-azaC對AA模型大鼠PMΦ產(chǎn)生IL-10 mRNA的影響 應(yīng)用RT-PCR檢測大鼠PMΦ中IL-10 基因表達變化顯示，與正常組比較，模型組大鼠PMΦ細胞中IL-10的mRNA表達明顯降低；給予5-azaC(5 μmol/L)干預(yù)后，與模型組比較，IL-10的mRNA表達明顯升高(圖3)。提示模型組大鼠PMΦ細胞中IL-10表達降低可能與甲基化有關(guān)。

2.2.35-azaC對AA模型大鼠PMΦ的IL-10啟動子甲基化的影響 實驗進一步通過MSP檢測，在AA模型大鼠PMΦ中，IL-10啟動子區(qū)發(fā)生高甲基化改變，而正常組大鼠 PMΦ中，IL-10啟動子區(qū)則處于低甲基化狀態(tài)；應(yīng)用5-azaC處理可降低AA模型大鼠PMΦ中IL-10啟動子區(qū)高甲基化狀態(tài)(圖4)。提示AA模型大鼠PMΦ中IL-10表達降低與其啟動子發(fā)生甲基化有關(guān)。

2.3AA模型大鼠PMΦ的DNMT1的mRNA變化為了進一步探討IL-10發(fā)生甲基化的機制，應(yīng)用RT-PCR檢測DNMT1的基因表達變化。結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠PMΦ中DNMT1的mRNA表達明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；給予5-azaC(5 μmol/L)干預(yù)顯示，與模型組比較，5-azaC可明顯降低DNMT1的mRNA表達(圖5)。

2.4AA大鼠PMΦ的DNMT1的蛋白表達變化應(yīng)用Western blot檢測AA大鼠PMΦ中DNMT1的蛋白表達變化，結(jié)果顯示模型組大鼠PMΦ中DNMT1蛋白的表達明顯上升，與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與模型組比較，5-azaC(5 μmol/L)刺激后DNMT1蛋白表達明顯降低(圖6)。上述結(jié)果表明IL-10發(fā)生甲基化的同時， DNMT1的表達同樣呈現(xiàn)顯著性變化，IL-10的甲基化可能與DNMT1相關(guān)。

表4 5-azaC在不同濃度和時間刺激細胞后的IL-10的表達變化

與正常組比較：**P<0.01 ； 與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01

圖6 Western blot法檢測AA大鼠PMΦDNMT1蛋白表達情況

與正常組比較：**P<0.01；與模型組比較：##P<0.01

3 討論

RA的主要病理特征是炎性細胞浸潤促進了滑膜組織增生，引起骨和軟骨破壞。RA是影響關(guān)節(jié)功能的主要疾病之一，探討其發(fā)病機制，為臨床尋找可能的作用靶點，是亟待解決的問題。合適的動物模型是研究RA發(fā)病機制的重要參考。以CFA誘導(dǎo)大鼠，炎性細胞浸潤、滑膜增厚、足腫脹顯著、骨及軟骨的侵蝕等病理特征與RA相似[5]，已作為研究RA發(fā)病的主要的動物模型。本實驗通過注射CFA誘導(dǎo)AA模型，結(jié)果顯示，與正常組比較，AA大鼠膝關(guān)節(jié)顯著紅腫、爬行困難，且大鼠足腫脹度、PI顯著高于正常組；病理檢查顯示，大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織存在明顯的炎性細胞浸潤及血管翳形成，關(guān)節(jié)囊滑膜增生呈乳頭狀突起，滑膜下層纖維組織明顯增厚，提示AA模型建立成功。

RA發(fā)病機制復(fù)雜，研究[3, 6]報道，在RA的病理過程中，巨噬細胞作為參與炎癥反應(yīng)的始動細胞，釋放多種炎癥因子，使得細胞因子平衡被打破，促進了RA的發(fā)生和發(fā)展。調(diào)節(jié)RA發(fā)病過程中紊亂的細胞因子可能為防治RA提供思路。抑炎因子IL-10具有廣泛的生物學(xué)活性，參與炎癥性腸病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)等多種疾病病程。文獻[7-8]報道，IL-10亦參與了RA的病程，在RA患者中，存在著IL-10表達降低。本實驗以大鼠PMΦ為研究對象，結(jié)果亦顯示，大鼠PMΦ中IL-10 mRNA及其分泌的IL-10蛋白表達顯著減少，表明IL-10的缺失可能是細胞因子網(wǎng)絡(luò)功能紊亂的一個重要原因。但IL-10表達減少其機制還不明確。

近期有研究[9-10]證實，表觀遺傳修飾參與了炎癥免疫性疾病(包括RA)的發(fā)生發(fā)展過程。DNA甲基化作為表觀遺傳修飾方式的一種， S-腺苷甲硫氨酸是其甲基供體，由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)將的甲基化基團催化轉(zhuǎn)移到DNA分子中，形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)，從而引起相關(guān)基因突變和轉(zhuǎn)錄沉默。多種的疾病的發(fā)病過程中均出現(xiàn)IL-10發(fā)生甲基化[11]。為了探明IL-10表達減少機制，實驗應(yīng)用去甲基化試劑5-azaC處理大鼠PMΦ，結(jié)果顯示，5-azaC可明顯增加IL-10的mRNA表達與蛋白分泌，提示AA大鼠PMΦ中IL-10降低，可能與其啟動子區(qū)域發(fā)生甲基化有關(guān)。進一步應(yīng)用MSP研究顯示，在AA大鼠PMΦ中IL-10啟動子區(qū)域發(fā)生了高甲基化。表明IL-10表達降低與其啟動子區(qū)域高甲基化密切相關(guān)。 DNMT1為催化并維持DNA甲基化的重要蛋白。本實驗亦觀察了其表達變化，結(jié)果顯示，AA大鼠PMΦ中，與正常組比較，伴隨著IL-10下降，DNMT1 mRNA和蛋白表達明顯升高，表明在AA大鼠中IL-10表達降低與其啟動子甲基化有關(guān)，而DNMT1可能是促進其發(fā)生甲基化的原因之一。

以上實驗結(jié)果提示，IL-10可能參與RA發(fā)病過程中炎癥因子失衡，IL-10表達的降低與其啟動子區(qū)域高甲基化狀態(tài)有關(guān)，DNMT1可能參與了IL-10的高甲基化形成。