張 雯，吳宏偉，于現(xiàn)闊，范建偉，蘇瑞強，郭非非，楊洪軍

(1.中國中醫(yī)科學院中藥研究所，北京 100700;2.成都中醫(yī)藥大學民族醫(yī)藥學院，成都 611137;3.魯南制藥集團股份有限公司中藥制藥共性技術國家重點實驗室，山東 臨沂 276006)

1 研究背景

瓜蔞薤白半夏湯出自東漢醫(yī)家張仲景所著《金匱要略》，該方由瓜蔞、薤白、半夏和白酒組成，為治療胸痹的經(jīng)典名方。胸痹作為中醫(yī)的證候描述，主要是由于正氣虛虧，痰濁，瘀血，氣滯，寒凝而引起心脈痹阻不暢，以胸部發(fā)生憋悶、氣短，伴有心慌，嚴重者可出現(xiàn)胸部疼痛。臨床上的諸多疾病均有胸痹的證候，例如冠心病、慢性充血性心力衰竭、緩慢性心律失常、病竇綜合征、心臟神經(jīng)官能癥、心肌炎、早搏、心臟X綜合征、急性冠狀動脈綜合征、反流性食管炎、慢性支氣管炎等。其中以冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(即冠心病)為胸痹的相關研究居多[1]?，F(xiàn)代研究表明，瓜蔞薤白半夏湯有防治心血管疾病和調(diào)節(jié)血脂的作用，它能擴張冠狀動脈、抑制血栓形成、抑制炎癥反應、抑制心肌細胞凋亡和調(diào)節(jié)血脂[2-3]。

中醫(yī)強調(diào)對癥下藥，即依據(jù)癥狀的精準用藥。胸痹對應如此多的臨床疾病，確定瓜蔞薤白半夏湯的臨床精準定位對于臨床使用該藥物具有重要意義。此外，針對于包括瓜蔞薤白半夏湯在內(nèi)的諸多經(jīng)典名方開發(fā)，臨床疾病的明確對于藥物的開發(fā)及臨床用藥的指導是不可或缺的。

本文以瓜蔞薤白半夏湯為例，基于網(wǎng)絡藥理學的分析方法，確定瓜蔞薤白半夏湯兩個主要的作用器官——心臟和肝臟，將其可能最有效的臨床病癥定位于急性的心臟疾病(例如心梗等)。此外，采用數(shù)據(jù)挖掘與先驗知識相結合，預測瓜蔞薤白半夏湯可能作用的心率、心肌細胞死亡、免疫炎癥、血管、脂質(zhì)代謝等五個病理環(huán)節(jié)，并挖掘其對應的潛在藥效成分。

2 研究方法

圖1 技術路線Fig.1 Technical flow chart

本研究主要分為以下幾個部分：1)基于ADMET化學成分的篩選能夠有效預測藥物的特性，實現(xiàn)類藥成分的快速篩選；2)基于相似性的藥物靶標預測，實現(xiàn)對于類藥成分的靶標快速確認；3)藥物潛在靶標的功能富集分析，挖掘藥物可能作用的通路和生物學過程以及可能治療的疾病類型；4)關鍵病理過程的關聯(lián)成分挖掘，用以鎖定潛在的藥效成分。技術路線見圖1。

2.1 瓜蔞薤白半夏湯化學成分的收集及篩選

通過文獻調(diào)研及TCMSP(http://tcmspnw.com)、TCMID(http://www.megabionet.org/tcmid/)等中藥成分數(shù)據(jù)庫收集瓜蔞薤白半夏湯的化學成分。在此基礎上，基于各化學成分的ADMET性質(zhì)篩選其中具有較好類藥性的成分用以后續(xù)計算分析。類藥性是指與良好的臨床療效相關的藥物的物理化學性質(zhì)(如溶解性、穩(wěn)定性等)。其中化合物的ADMET預測可以快速描述藥物在生物體內(nèi)的吸收、分布、代謝與排泄過程和毒性反應的特征，用于后續(xù)的類藥篩選。中藥復方中包含大量成分，能在人體內(nèi)發(fā)揮藥效作用的成分必須同時具備足夠優(yōu)秀的藥理活性和類藥性質(zhì)[4]，剔除類藥性較差的化合物，發(fā)現(xiàn)更多可能的藥效成分，以便進一步的分析。

本文利用FAF-Drugs4數(shù)據(jù)庫[5](http://fafdrugs3.mti.univ-paris-diderot.fr/)對瓜蔞薤白半夏湯的化學成分進行篩選[6]，預測其ADMET特性，隨后基于表1的類藥性質(zhì)參數(shù)，篩選理化性質(zhì)接近上市藥物的化學成分。

表1 類藥性質(zhì)參數(shù)Tab.1 Main Parameters

2.2 基于藥物-靶標相似性的瓜蔞薤白半夏湯的藥物靶點預測

本文基于BATMAN-TCM對于類藥化合物的靶標進行預測[10]。BATMAN-TCM所使用的靶標預測方法是基于相似性來預測中藥組成化合物的潛在靶標的。它的核心思想是由Perlman等人首次提出的，實質(zhì)是通過與已知的藥物靶標的相互作用比較來計算相似性，并對潛在的藥物靶標相互作用進行排序[11]。本文將篩選后的類藥化學成分分別以全方、瓜蔞、半夏、薤白四種組合導入BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫進行靶點預測，獲得與瓜蔞薤白半夏湯化學成分可能發(fā)生相互作用的靶標蛋白，并選擇其中高可信度(打分值大于20)的蛋白作為藥物的候選靶點[12]。

2.3 藥物潛在靶點功能富集分析

靶標分析功能基于功能條目的富集分析，用以考察該方的潛在靶標可能具有的生物學功能及參與的生物學通路。功能分析中涉及的GO功能條目，KEGG生物學通路，疾病條目以及組織特異性相關的分析均使用DAVID工具完成[13-14]。富集分析是基于超幾何分布設計的算法，而針對富集分析顯著性P-value的多重檢驗校正則使用的Benjamini-Hochberg校正方法。具體來說，本文將預測得到的藥物潛在靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫進行疾病富集，得到瓜蔞薤白半夏湯可能的主治病癥。對全方、瓜蔞、半夏、薤白分別進行組織分布富集，再對富集到組織心臟和肝臟的靶點進行GO功能和KEGG通路富集。

2.4 “化合物成分-靶點-通路/功能”網(wǎng)絡構建

根據(jù)前期文獻挖掘得到的中藥-成分關系，BATMAN-TCM平臺的成分-靶點關系、DAVID數(shù)據(jù)庫的靶點-功能通路關系，建立數(shù)據(jù)文件，利用Cytoscape 3.5.1軟件繪制“成分-靶點-通路-功能”網(wǎng)絡圖。

3 結果

3.1 瓜蔞薤白半夏湯的類藥成分及潛在靶標

根據(jù)數(shù)據(jù)庫和文獻挖掘的結果，得到瓜蔞薤白半夏湯780個化學成分。其中瓜蔞352個成分，包括氨基酸類17個，黃酮及酚類25個，揮發(fā)油、油脂和有機酸類185個，生物堿及含氮類29個，糖類9個，萜類45個，植物甾醇29個，其他成分32個；半夏有261個成分，包括氨基酸類22個，苯丙素類25個，環(huán)肽類6個，揮發(fā)油、油脂和有機酸類188個，生物堿及含氮類14個，甾醇類6個，其他成分12個；薤白有成分167個，含氮化合物9個，揮發(fā)油及脂肪酸類55個，甾體皂苷87個，其他成分17個。利用FAF-Drugs4數(shù)據(jù)庫篩選后得到成分294個，其中瓜蔞137個，半夏114個，薤白43個。篩選前后的物理性質(zhì)分布對比見圖2。根據(jù)BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫的預測結果，得到全方靶點710個，瓜蔞靶點654個，薤白靶點99個，半夏靶點587個

圖2 成分理化性質(zhì)篩選前后分布情況Fig.2 Physical-chemical characters before and after secection

Term條目CountPValueLiver肝1604.20e-18Heart心501.10e-07Skeletal muscle骨骼肌432.03e-05Hippocampus海馬359.62e-05Brain cortex大腦皮層152.08e-04

3.2 瓜蔞薤白半夏湯的臨床精準定位

3.2.1 潛在靶標的組織特異性

為了考察瓜蔞薤白半夏湯的主要作用器官，本文將全方靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫，進行組織分布富集，富集結果顯示全方作用的靶點大量富集到肝臟和心臟(見表2)，胸痹病位在心，與肝也有密切關系，基本病機為肝心失調(diào)[15]，后續(xù)分析將重點關注富集到肝臟和心臟的靶點。

3.2.2 心臟相關靶標的疾病富集結果

為了確認瓜蔞薤白半夏湯的可能作用的疾病，本文使用DAVID對全方靶點進行了疾病富集分析，富集到大量與心梗相關疾病的疾病條目(表3)，如心肌梗塞、心血管疾病、冠狀動脈心臟疾病等。

表3 全方心梗相關疾病富集結果(P-Value≤0.01)Tab.3 Full-close result(P-Value≤0.01)

3.2.3 瓜蔞薤白半夏湯的潛在靶向的通路

對于富集到肝臟和心臟的靶點再次導入DAVID數(shù)據(jù)庫，分別進行功能和通路富集，得到瓜蔞薤白半夏湯作用于心臟和肝臟的功能和通路(見表4)，可知全方對于心臟的作用可能集中于調(diào)節(jié)心率、擴張血管，以及心肌細胞存活、免疫炎癥的調(diào)控等，而在肝臟發(fā)揮的作用可能集中于脂質(zhì)代謝方面。

表4 全方在肝臟和心臟部位的功能通路(PValue≤0.05)Tab.4 Functional path of full-close on liver and heart

3.2.4 瓜蔞薤白半夏湯臨床定位的確定

基于以上結果，我們初步認為，瓜蔞薤白半夏湯的臨床應用主要是以心肌梗塞為主的心血管疾病。心肌梗塞是指由于各種原因引起的心血管中血液流通的異常，冠狀動脈阻塞，導致心臟供血不足而心肌壞死，嚴重者發(fā)展為心肌梗死有極高的致死率[16]。國內(nèi)每年有超過300萬的心肌梗塞患者，且該數(shù)字正日益增長[17]，故瓜蔞薤白半夏湯治療心肌梗塞的作用機理和藥效物質(zhì)基礎研究尤為重要?；诟患治龅慕Y果，瓜蔞薤白半夏湯可能通過調(diào)控心率，影響免疫炎癥、心肌細胞的死亡、血管的功能以及調(diào)控脂質(zhì)代謝等方面發(fā)揮作用。

4 瓜蔞薤白半夏湯潛在藥效物質(zhì)的篩選

根據(jù)上述功能/通路富集結果，將瓜蔞薤白半夏湯影響的生物過程分為心率、心肌細胞死亡、免疫炎癥、血管、脂質(zhì)代謝5類，為了能夠進一步挖掘這5類生理過程與瓜蔞薤白半夏湯類藥成分之間的關聯(lián)，本文構建“藥物-成分-靶標-通路”圖用以描述。(2，3，4，5，6)。

4.1 心率調(diào)節(jié)相關的潛在藥效成分

由圖3可知，富集得到的心率相關通路有通過心臟傳導調(diào)節(jié)心率(regulation of heart rate by cardiacconduction)和鈣離子信號通路。研究表明鈣超載可以使心肌部分去極化，引起缺血性心律失常，并且鈣離子電流任何微小的變化即可導致其他離子電流改變，造成心肌電活動異常，調(diào)節(jié)鈣信號通路，抑制鈣超載可以明顯減小心梗后心律失常的發(fā)生率[18]。鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate)是三味藥共有的成分，均可能參與心率相關通路的調(diào)節(jié)。有研究證明鄰苯二甲酸二丁酯具有引起血管收縮作用，初步機制可能涉及細胞膜電壓門控性鈣通道及鈣離子內(nèi)流[19]。degree值較高的化學成分有異亮氨酸(isoleucine)和亮氨酸(leucine)等，氨基酸對心血管功能有保護作用，不僅可減輕心肌在缺血再灌注、心力衰竭和心肌梗塞中的損傷，而且對血壓、血脂和心律失常也有一定的調(diào)節(jié)作用[20]。

圖3 心率相關“藥物-成分-靶標-通路”Fig.3 Heart-rate related medicine-component-target-path

圖4 心肌細胞死亡相關“藥物-成分-靶標-通路”Fig.4 Cardiomyocyte medicine-comconet-target-path

4.2 心肌細胞死亡相關的潛在藥效成分

圖4中富集得到的心肌細胞死亡相關通路有MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)，該通路調(diào)節(jié)多種細胞活動，包括增殖，分化，存活和死亡[21]。degree值較高的化學成分有對香豆酸(p-coumaric acid)，畢思玲[22]發(fā)現(xiàn)川芎嗪對香豆酸能抑制缺血損傷大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞瘤(PC12)細胞凋亡，陳智[23]等人研究證明了對香豆酸組合物對急性髓系白血病(AML)細胞的增殖抑制作用，故對香豆酸能否調(diào)節(jié)心肌細胞死亡有待進一步研究。

4.3 炎癥應答相關的潛在藥效成分

圖5富集得到的功能有負調(diào)控急性炎癥反應，全身或局部的炎癥反應，可能在急性心肌梗死的發(fā)生、發(fā)展和心血管事件中起重要作用[24]。

圖5 免疫炎癥相關“藥物-成分-靶標-通路”Fig.5 Immunity related medicine-componet target-path

4.4 血管相關的潛在藥效成分

圖6富集得到的與血管相關的通路有PPAR信號通路(PPAR signaling pathway)和血管平滑肌收縮(Vascular smooth muscle contraction)。高飛[25]等人通過研究證明了PPAR-γ激動劑能抑制血管緊張素Ⅱ誘導血管平滑肌細胞的表型轉化，可以推測PPAR信號通路可能與血管平滑肌有關，從而參與心肌梗塞的病理過程，陳蘭玉[26]基于PPAR信號通路探討桑杞清眩顆粒對高血壓心肌纖維化作用機制的研究，得出PPARα和PPARγ通過對炎性因子的開關效應影響了心肌重構的結論。甲基丁香酚(methyl eugenol)來自半夏，Lahlou S[27]等發(fā)現(xiàn)它可以引起小鼠低血壓，可能是直接作用于血管平滑肌而擴張血管。

圖6 血管相關“藥物-成分-靶標-通路”Fig.6 Blood vessel related medicine-componet target-path

4.5 脂質(zhì)代謝相關的潛在藥效成分

圖7富集得到了脂質(zhì)分解代謝過程的負調(diào)控和脂肪酸代謝等與脂質(zhì)代謝有關的功能和通路。

圖7 脂質(zhì)代謝相關“藥物-成分-靶標-通路”Fig.7 Lipid metabolism related medicine-component-target-path

5 討論

瓜蔞薤白半夏湯為中醫(yī)藥經(jīng)典名方，功效行氣解郁，通陽散結，祛痰寬胸，主治胸痹，現(xiàn)代研究表明該方有較好的防治心血管疾病和調(diào)節(jié)血脂的作用，其正丁醇部位、水溶性部位、和藥渣水煎液部位能保護缺血缺氧損傷的心肌細胞[28]。本研究收集得到瓜蔞化學成分352個，半夏261個，薤白167個，通過類藥性成分篩選，靶點預測，臨床疾病定位，組織分布和功能通路富集，發(fā)現(xiàn)瓜蔞薤白半夏湯作用的部位在心臟和肝臟，對應的現(xiàn)代病癥可能是以心肌梗塞為主的心血管疾病，其作用機制可能有：通過心臟傳導調(diào)節(jié)心率和鈣信號通路等與調(diào)節(jié)心率有關的過程，心肌細胞死亡相關的MAPK信號通路，負調(diào)控急性炎癥反應，PPAR信號通路和血管平滑肌收縮等與調(diào)節(jié)血管平滑肌有關的過程，以及脂質(zhì)分解代謝過程的負調(diào)控和脂肪酸代謝等脂質(zhì)代謝相關過程，并進一步得到了107個可能作用于以上各生物過程的化學成分，比如三味藥共有的成分鄰苯二甲酸二丁酯，能調(diào)節(jié)鈣離子內(nèi)流影響心率，來自半夏的甲基丁香酚，可能作用于血管平滑肌而擴張血管。通過網(wǎng)絡藥理學分析瓜蔞薤白半夏湯的臨床應用及藥效成分，后續(xù)將進行其相應的實驗驗證研究，進一步明確其作用物質(zhì)基礎及分子作用機制。