陳志春 ，張理平 ，王英豪 ，楊 策 ，蘭明金

（1.福州屏山制藥廠，福建 福州 350003；2.福建中醫(yī)藥大學，福建 福州 350122）

色素增多性皮膚病是臨床上一類常見的皮膚病，有文獻［1］報道，僅黃褐斑在妊娠婦女中的發(fā)病率就高達53%，因此如何找尋有效抑制黑色素合成的天然藥物是目前研究的科學熱點之一。中藥復方活性成分復雜，藥理作用往往呈現(xiàn)出多環(huán)節(jié)、多途徑的特點，課題組認為這也正是其針對色素增多性皮膚病的復雜病理，具有較好綜合療效優(yōu)勢的重要原因，在前期的實驗研究中亦證實了祛斑中藥組方治療色素增多性皮膚病的療效確切，且呈現(xiàn)出多途徑、多靶點的特點［2-5］。但如何剖析復方中不同作用環(huán)節(jié)或途徑的主效應中藥或物質基礎，揭示藥效與其物質基礎的相關性，亟待解決。因此本研究在前期實驗［6］的基礎上，從自由基清除作用、SOD樣活性、抗紫外線催化作用和促黑色素分解作用等不同作用途徑為切入點，深入剖析組方中干預黑色素合成不同作用環(huán)節(jié)的主效應中藥，為研究治療色素增多性皮膚病藥物提供實驗依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UV236B中波紫外線照射儀（德國Waldman公司）；FA20004N型電子分析天平（上海精密科學儀器有限公司）；UV-9100型紫外-可見分光光度計（北京瑞利分析儀器公司）；Anke TDL80-2B型離心機（上海安亭科學儀器廠）；HH.S型數(shù)顯水浴鍋（上海錦屏儀表有限公司）；KQ-500E型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；PIPETTOR微量移液器（WKY型 100～500 μL，上海求精生化試劑儀器有限公司）。

1.2 試藥 山楂、山茱萸、當歸等藥材均購于福建中醫(yī)藥大學國醫(yī)堂，經鑒定：山楂為薔薇科植物山里紅 Crataegus pinnatifida Bge.var.major N.E.Br.的干燥成熟果實；山茱萸為山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.et Zucc.的干燥成熟果肉；當歸為傘形科植物當歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根。左旋多巴（L-Dopa，西安潤澤生物技術有限公司）；1，1-二苯基苦肼基（DPPH，美國 Sigma 公司）；黃嘌呤氧化酶（美國Sigma公司）；鹽酸羥胺、次黃嘌呤、萘乙二胺鹽酸鹽、無水對氨基苯磺酸、醋酸、乙醇等試劑均為分析純。

2 方 法

2.1 析因試驗設計 參照前期實驗［6］，本研究選用3×2析因設計表，以山楂、當歸、山茱萸為考察因素，每個因素設2個水平，進行組方設計（見表1），得到表2的析因設計實驗方案，其中一行為一種組方，按表中行數(shù)值取相應克數(shù)的藥混合即得此組方，共8組。

表1 因素水平表g

2.2 組方的制備 將組方（山楂、當歸、山茱萸等藥）的飲片分別粉碎成粗粉（40目）后，按表1量分別稱取適量粉末于具塞三角瓶中，并加入適量乙醇（見表 2），混勻，浸泡 0.5 h，超聲提取 1 h，提取 2次。分別過濾，減壓回收乙醇，制得濃度為250 g／L的藥液，備用。

2.3 自由基清除作用的測定 參考文獻［7］的方法，取1 mL受試物（1～8號）的制備液，分別加到1 mL DPPH （0.1 mM）溶液中，在 37℃溫育 30 min，用分光光度計在516 nm處測定OD值。以乙醇代替受試物作為空白對照。自由基清除率的計算公式：

表2 析因設計實驗方案

式中：Ai為1 mL DPPH溶液＋1 mL受試物；Aj為1 mL乙醇＋1 mL受試物；Ao為1 mL DPPH溶液＋1 mL乙醇（空白對照）。

2.4 SOD樣活性的測定 參考文獻［8］的方法，先將0.2 mL反應物A溶液（0.5 mM次黃嘌呤，10 mM鹽酸羥胺）和0.8 mL受試物（1～8號）溶液［用EDTA-PBS（pH8.2）溶解受試物］，在37℃下培養(yǎng)10 min，接著將0.2 mL黃嘌呤氧化酶溶液（5 mU／mL）加入到上述溶液中，并將該混合物培養(yǎng)30 min；然后將2 mL反應物B（終濃度為 20 μMN-1-萘乙二胺鹽酸鹽，2 mM對氨基苯磺酸，16.7%醋酸）加入到上述混合物中，在室溫下維持 30 min，用分光光度計在550 nm處測定OD值。SOD樣活性用抑制次黃嘌呤氧化酶催化所產生的超氧陰離子的百分比表示。以PBS代替受試物作為空白對照。

2.5 抗紫外線催化作用的測定 參考文獻［9］的方法，先將3 mL多巴溶液（0.03%）和3 mL PBS溶解的受試物（1～8號）混合，在25℃下用紫外線照射儀照射10 h，然后用分光光度計在475 nm處測定OD值。以PBS代替受試物作為空白對照。

2.6 促黑色素分解作用的測定 參考文獻［9］的方法，將3 mL多巴溶液（0.03%）用紫外線照射儀照射18 h，生成黑色素后，加入3 mL用PBS稀釋過的受試物（1～8號），搖勻，25℃下放置 12 h，然后用分光光度計在475 nm處測定OD值。以PBS代替受試物作為空白對照。

2.7 解析組方中主效應中藥 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。析因分析采用F檢驗，結果以（x±s）表示，分別解析祛斑中藥的自由基清除作用、SOD樣活性、抗紫外線的催化作用、促黑色素分解作用的主效應、交互效應、單獨效應。

3 結 果

3.1 對自由基清除作用的影響 組方對自由基清除的作用試驗結果見表3。經析因分析，A、B、C因素兩兩交互效應見圖1。圖1中BC因素兩條直線相互不平行，說明兩因素存在交互作用，即組方對自由基清除作用存在交互效應，故需考慮交互作用。由 F 檢驗結果（表 4）可知：FC因素＞FA因素＞FB因素*C因素＞FB因素，其中 C 因素有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）；A、B、B*C 因素無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。 因 C 因素與B因素存在交互作用，但B*C因素P＞0.05，故只需分析主效應中藥。C因素（山茱萸）的貢獻度遠比A因素（山楂）、B因素（當歸）大，處于絕對主導地位，尤其是山茱萸水平1對自由基清除作用最強（見圖1），是復方中自由基清除作用的主效應中藥。

表3 各組方干預黑色素合成結果%

表3 各組方干預黑色素合成結果%

組方試驗號12345678自由基清除活性抑制率60.5±3.2 17.5±1.9 50.9±3.4 31.0±5.5 47.6±4.5 22.9±3.9 52.8±5.3 13.7±2.9 SOD樣活性抑制率43.2±5.1 51.2±6.4 39.7±4.3 36.8±4.0 45.9±3.9 47.9±5.5 65.5±7.1 37.9±5.6抗紫外線催化作用抑制率40.0±4.3 37.4±3.5 43.1±5.1 47.8±3.9 46.4±4.4 57.4±6.2 53.6±4.8 51.0±6.0促黑色素分解作用抑制率24.4±3.1 21.9±3.0 27.6±2.5 22.1±5.0 18.2±3.9 17.8±1.9 16.0±1.4 29.7±2.2

表4 自由基清除作用析因方差分析表

3.2 對SOD樣活性的影響 組方對SOD樣活性的試驗結果見表3。F檢驗結果（表5）可知：A因素對SOD樣活性影響最大，但A、B、C三因素均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。組方對SOD樣活性的抑制作用是此復方的整體效應。

3.3 對抗紫外線催化作用的影響 組方對抗紫外線催化作用的試驗結果見表3。經析因分析，A、B、C因素兩兩交互效應見圖2。圖2中兩條直線均相互平行，說明因素間不存在交互作用，即組方對抗紫

圖1 自由基清除作用的交互作用圖

表5 SOD樣活性析因方差分析表

外線催化作用不存在交互效應，故只需考慮各因素的主效應作用。由F檢驗結果（表6）可知：FA因素＞＞FB因素＞Fc因素，其中 A 因素有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）；B、C 因素無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。可見 A 因素（山楂）的貢獻遠比B因素（當歸）、C因素（山茱萸）大，處于絕對主導地位，尤其山楂水平2對抗紫外線催化作用具顯著抑制作用（p＜0.05），見圖2，是復方中抗紫外線催化作用的主效應中藥。

表6 抗紫外線催化作用析因方差分析表

圖2 抗紫外線催化作用的交互作用圖

3.4 對促黑色素分解作用的的影響 組方對促黑色素分解作用的試驗結果見表3。F檢驗結果（表7）可知：A因素對促黑色素分解作用的影響最大，但A、B、C三因素均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。組方對促黑色素分解作用的抑制作用是此復方的整體效應。

表7 促黑色素分解作用析因方差分析表

4 討論

色素增多性皮膚病是皮膚科、美容科常見的疑難病癥，現(xiàn)代醫(yī)學治療多采用維甲酸、壬二酸、曲酸、止血環(huán)酸、果酸、抗壞血酸等藥物，祖國醫(yī)學治療則常用山茱萸、黃芩、紅花、大黃等中藥，但迄今為止中西醫(yī)都尚無療效確切的治療良藥［10-11］。祛斑中藥復方是課題組治療色素增多性皮膚病的常用驗方，前期實驗表明其對酪氨酸酶的活性有很強的抑制作用［2-5］，故推測祛斑中藥復方的多途徑、多靶點的作用特點，是其綜合治療色素增多性皮膚病的特色和優(yōu)勢。盡管該復方是基于臨床實踐以及相關組方配伍理論而建立的，但其多途徑、多靶點藥理效應終究是其復雜的、特定的物質基礎反應。因而，我們進一步剖析了祛斑中藥復方不同作用途徑的主要中藥，發(fā)現(xiàn)山茱萸是方中酪氨酸酶活性抑制、多巴自動氧化抑制的主效應中藥［6］。

然黑色素合成是一個較為復雜的過程，該過程除與酪氨酸酶、多巴色素自動氧化等因素密切相關外，還與自由基、黑色素降解及紫外線等因素密切相關。因而本實驗又進行了DPPH自由基清除作用及SOD樣活性的研究。DPPH自由基清除試驗和SOD樣活性試驗均是針對自由基的，前者消除的是中等穩(wěn)定的DPPH自由基，后者消除的則是極不穩(wěn)定的超氧陰離子。本研究結果表明：組方對自由基均呈現(xiàn)出一定的抑制作用；對超氧陰離子的抑制是組方的整體效應；而對DPPH自由基，各藥抑制率依次為 FC因素＞FA因素＞FB因素*C因素＞FB因素， 山茱萸的貢獻度遠比山楂、當歸大，處于絕對主導地位，山茱萸對DPPH自由基抑制明顯（p＜0.05），是方中自由基清除作用的主效應中藥。本實驗還進行了促黑色素分解作用及抗紫外線催化作用的研究，結果表明：促黑色素分解作用是組方的整體效應；各藥對抗紫外線催化作用的抑制率依次為FA因素＞＞FB因素＞Fc因素，山楂的貢獻遠比當歸、山茱萸大，處于絕對主導地位，山楂對抗紫外線催化作用抑制明顯（p＜0.05），是方中抗紫外線催化作用的主效應中藥。

正是由于中藥復方具有多途徑、多靶點、多系統(tǒng)的藥理效應，必然存在不同作用途徑的主要中藥或主要物質基礎。本研究在前期實驗的基礎上進一步明確了祛斑中藥復方在治療色素增多性皮膚病不同黑色素合成途徑方面的主效應中藥或組合，研究結果從某種程度上印證了這一理論。這種研究模式，既對中藥復方配伍的現(xiàn)代詮釋具有重要意義，又可為高效、廉價、安全的祛斑中藥研發(fā)提供思路。