游 旅,何尋面,韋小瑜,李世軍,王 斌,黃 荷,唐光鵬,朱 琳,王定明

沙門(mén)菌是全球范圍內(nèi)感染性腹瀉最常見(jiàn)的病原菌之一,是重要的食源性致病菌及人獸共患致病菌.人類(lèi)可通過(guò)進(jìn)食受到沙門(mén)菌污染、且未通過(guò)適當(dāng)烹飪或處理的食品、水,或接觸受到污染的蛋、奶及其制品、肉類(lèi)、食品等從而感染沙門(mén)菌導(dǎo)致沙門(mén)菌性腸炎和敗血癥等,常常引起食源性疾病的暴發(fā)[1].近年來(lái),沙門(mén)菌感染在全世界普遍流行,在許多國(guó)家和地區(qū)已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題.據(jù)統(tǒng)計(jì),全球每年估計(jì)發(fā)生將近13億因沙門(mén)菌導(dǎo)致的急性胃腸炎病例,其中300萬(wàn)患者死亡[2],在我國(guó),每年因沙門(mén)菌感染而致病的約有903萬(wàn)[3].貴陽(yáng)市在2010－2015年感染性腹瀉病原菌中發(fā)現(xiàn),沙門(mén)菌是貴陽(yáng)市引起感染性腹瀉的主要病原菌,且近年由沙門(mén)菌引起的食物中毒事件時(shí)有發(fā)生[4-7].本研究收集2013－2014年貴陽(yáng)市4家哨點(diǎn)醫(yī)院感染性腹瀉病例的糞便標(biāo)本進(jìn)行沙門(mén)菌的分離培養(yǎng)、血清分型及PFGE分子分型,了解貴陽(yáng)市感染性腹瀉病例中沙門(mén)菌的檢出情況、血清型分布及PFGE分子流行特征,為貴陽(yáng)市沙門(mén)菌引起的感染性腹瀉疫情或食物中毒事件、實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)及防控預(yù)警提供技術(shù)支持.

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 以貴陽(yáng)市4家哨點(diǎn)醫(yī)院作為監(jiān)測(cè)點(diǎn),其中包括一家兒童醫(yī)院,將符合腹瀉監(jiān)測(cè)病例定義的患者即24 h內(nèi)連續(xù)腹瀉3次及以上且伴有稀便、水樣便、粘液便、膿血便、米泔樣便等糞便性狀異常者,列為感染性腹瀉監(jiān)測(cè)病例對(duì)象.采集感染性腹瀉病例糞便標(biāo)本5 m L(或5 g)于50 m L含卡布運(yùn)送培養(yǎng)基的螺旋管中,24 h內(nèi)送往腸道病原菌檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè).2013年1月至2014年12月收集到432份感染性腹瀉糞便標(biāo)本.

1.2 主要試劑和儀器 沙門(mén)菌顯色培養(yǎng)基購(gòu)自法國(guó)CHROMAgar公司;亞硒酸鹽煌綠增菌液(SBG)購(gòu)自北京友康生物公司;API20E生化鑒定條購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司;沙門(mén)菌診斷血清、Swarm Agar誘導(dǎo)軟瓊脂購(gòu)自丹麥SSI公司;TBE購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;蛋白酶K購(gòu)自德國(guó)Merck公司;Xba I酶購(gòu)自大連寶生物工程有限公司;Seakem Gold瓊脂購(gòu)自美國(guó)LONZA公司;Gel Red染料購(gòu)自美國(guó)Biotium公司;CHEF Mapper脈沖場(chǎng)電泳儀和Gel Doc2000凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司.

1.3 標(biāo)本的分離培養(yǎng)、鑒定及血清分型 標(biāo)本經(jīng)SBG增菌后接種至沙門(mén)菌顯色平板上,36℃培養(yǎng)過(guò)夜,從沙門(mén)菌顯色培養(yǎng)基上挑取淡紫色菌落接種至克氏雙糖和MIU進(jìn)行初步生化鑒定后,符合沙門(mén)菌初步生化的菌株進(jìn)一步采用API20E生化鑒定板條進(jìn)行系統(tǒng)生化鑒定,對(duì)明確鑒定為沙門(mén)菌的菌株轉(zhuǎn)種至哥倫比亞營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板進(jìn)行沙門(mén)菌O相血清凝集,并點(diǎn)種至Swarm Agar軟瓊脂平板進(jìn)行H相血清凝集,生理鹽水作對(duì)照.根據(jù)Kauffman-White血清分型表確定對(duì)應(yīng)血清型別.

1.4 PFGE分子分型和聚類(lèi)分析 根據(jù)國(guó)際PulseNet網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室公布的沙門(mén)菌PFGE標(biāo)準(zhǔn)分型方法,對(duì)監(jiān)測(cè)中分離的沙門(mén)菌進(jìn)行PFGE分子分型,Xba l進(jìn)行酶切,以H9812菌株作為參比菌株.應(yīng)用BioNumerics 7.5軟件對(duì)電泳圖譜進(jìn)行聚類(lèi)分析,聚類(lèi)算法為非加權(quán)配對(duì)平均法(UPGMA).

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,統(tǒng)計(jì)方法包括卡方檢驗(yàn)和Fisher確切概率法,P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié) 果

2.1 感染性腹瀉病例中沙門(mén)菌的檢出情況及血清型分布 對(duì)2013－2014年收集的432例感染性腹瀉患者的糞便標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)及鑒定,結(jié)果共檢出沙門(mén)菌35株,檢出率為8.10%(35/432),其中腸炎沙門(mén)菌檢出率最高為2.55%(11/432),其次為鼠傷寒沙門(mén)菌2.08%(9/432),各血清型檢出情況見(jiàn)表1.

2.2 感染性腹瀉病例中沙門(mén)菌的流行病學(xué)分布特征

2.2.1 性別分布 432例感染性腹瀉病例中男251例、女181例,沙門(mén)菌檢出率分別為8.37%(21/251)和7.73%(14/181),男女檢出之比為1.5∶1,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2＝0.056,P＞0.05).

表1 35株沙門(mén)菌的血清分型結(jié)果Tab.1 Serovars of 35 Salmonella strains from 432 samples

2.2.2 年齡分布 發(fā)病年齡多集中在0～5歲,檢出率為8.91%(32/359),占沙門(mén)菌檢出數(shù)的91.43%(32/35);≥6歲大年齡組檢出率為4.11%(3/73),占8.57%,經(jīng)卡方檢驗(yàn)兩個(gè)年齡組沙門(mén)菌檢出率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2＝1.880,P＞0.05).

2.2.3 時(shí)間分布 432例腹瀉病例據(jù)月份分為4組:1－3月份、4－6月份、7－9月份及10－12月份,沙門(mén)菌檢出率分別為8.11%(3/37)、2.86%(1/35)、11.30%(26/230)及3.85%(5/130),經(jīng) Fisher確切概率法比較P＝0.052,各季度間檢出率比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

2.3 主要血清型沙門(mén)菌PFGE分型及聚類(lèi)結(jié)果采用Bio Numerics7.5軟件,對(duì)貴陽(yáng)市主要血清型沙門(mén)菌腸炎沙門(mén)菌和鼠傷寒沙門(mén)菌的PFGE圖像進(jìn)行聚類(lèi)分析,結(jié)果本次研究中分離的11株腸炎沙門(mén)菌,經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶XbaⅠ進(jìn)行酶切,PFGE獲得8種帶型,其中JEGX01.CN0007有3株,JEGX01.CN0003有2株,其余均為1株;本次研究中分離的9株鼠傷寒沙門(mén)菌,經(jīng)酶切獲得9種PFGE帶型,見(jiàn)圖1和圖2.

圖1 2013－2014年貴陽(yáng)市腹瀉病例中腸炎沙門(mén)菌PFGE聚類(lèi)結(jié)果Fig.1 Clustering results of PFGE patterns of S.enteritidis strains from infectious diarrheal patients in Guiyang from 2013 to 2014

圖2 2013－2014年貴陽(yáng)市腹瀉病例中鼠傷寒沙門(mén)菌PFGE聚類(lèi)結(jié)果Fig.2 Clustering results of PFGE patterns of S.typhimurium strains from infectious diarrheal patients in Guiyang from 2013 to 2014

3 討 論

本研究顯示,2013－2014年貴陽(yáng)市感染性腹瀉病例中沙門(mén)菌的檢出率為8.10%,高于廣東省、無(wú)錫市的檢出率[8-9].35株沙門(mén)菌共分為9種血清型,優(yōu)勢(shì)血清型為腸炎沙門(mén)菌和鼠傷寒沙門(mén)菌,與廣東、無(wú)錫、泰安等地的研究結(jié)果一致[8-10],提示在對(duì)貴陽(yáng)市感染性腹瀉的病原監(jiān)測(cè)中要重點(diǎn)加強(qiáng)對(duì)腸炎沙門(mén)菌和鼠傷寒沙門(mén)菌的監(jiān)測(cè).從年齡分布看,發(fā)病年齡多集中在0～5歲,占沙門(mén)菌檢出數(shù)的91.43%,其檢出率為8.91%,該結(jié)果與深圳市龍崗區(qū)2010－2012年感染性腹瀉沙門(mén)菌的研究結(jié)果一致[11],但與北京市發(fā)病年齡集中在18～40歲不同[12],提示沙門(mén)菌感染特征存在地域差異.0～5歲低年齡組的嬰幼兒是貴陽(yáng)市沙門(mén)菌的重點(diǎn)監(jiān)測(cè)對(duì)象.從時(shí)間分布看,各季度均有沙門(mén)菌檢出,無(wú)明顯的季節(jié)分布趨勢(shì).但檢出沙門(mén)菌陽(yáng)性數(shù)在7－9月份居多,提示7－9月感染性腹瀉的高發(fā)季節(jié)也是易感染沙門(mén)菌的季節(jié),應(yīng)加強(qiáng)沙門(mén)菌的監(jiān)測(cè).

為進(jìn)一步了解貴陽(yáng)市分離的主要血清型沙門(mén)菌分子流行病學(xué)特征,我們采用PFGE分型方法對(duì)沙門(mén)菌進(jìn)行分子分型發(fā)現(xiàn)11株腸炎沙門(mén)菌分為8個(gè)PFGE型別,菌株間相似性＞85%,優(yōu)勢(shì)帶型為JEGX01.CN0007;9株鼠傷寒沙門(mén)菌分為9個(gè)PFGE帶型,且菌株間相似性?xún)H為54%,揭示貴陽(yáng)市2013－2014年鼠傷寒沙門(mén)菌并未形成流行或聚集性病例,而是高度散發(fā).PFGE分型結(jié)果提示貴陽(yáng)市腹瀉病例沙門(mén)菌分離株P(guān)FGE型別呈多樣性分布.沙門(mén)菌為人獸共患病原菌和食源性病原菌,可通過(guò)污染的食物等感染,因此,沙門(mén)菌的有效防控應(yīng)在加強(qiáng)人間病例監(jiān)測(cè)的同時(shí),需加強(qiáng)動(dòng)物沙門(mén)菌病的防控以及食源性沙門(mén)菌的監(jiān)測(cè).由于本研究中監(jiān)測(cè)年限較短,監(jiān)測(cè)地區(qū)局限,且僅為感染性腹瀉病例的研究,為全面的反映貴州省沙門(mén)菌感染狀況及分子流行病學(xué)特征,還需加大監(jiān)測(cè)范圍,同時(shí)對(duì)食品和動(dòng)物來(lái)源的沙門(mén)菌進(jìn)行監(jiān)測(cè)分析,以提供全面的監(jiān)測(cè)資料,為沙門(mén)菌病的防控提供可靠的防控依據(jù).