盧 君，山其木格，王 麗，孟天毅，張忠奎，李長文，

（1.天士力控股集團(tuán)有限公司研究院，天津300410；2.貴州國臺酒業(yè)有限公司，貴州仁懷564501）

醬香型白酒以其感官風(fēng)味特征的豐富性，深受消費(fèi)者的喜愛。醬香型白酒“三高三長”的工藝，即高溫制曲、高溫堆積發(fā)酵、高溫餾酒、基酒生產(chǎn)周期長、基酒酒齡時間長、大曲儲存時間長，以及參與其中的微生物菌群的作用，決定了醬香白酒物質(zhì)組成的復(fù)雜性和感官風(fēng)格的豐富性[1]。

醬香型白酒生產(chǎn)過程中主要有3種典型體的基酒，分別為窖面酒、窖底酒和醇甜酒[2]。窖面酒醬香突出、曲香明顯、略澀、后味綿長；醇甜酒醬香突出，具有醇甜味，后味爽凈；窖底酒具有部分濃香型酒風(fēng)格，醬香明顯，濃厚豐滿[3]。其中窖面酒主要體現(xiàn)醬香和曲香的風(fēng)格，對于醬香白酒主體香的呈現(xiàn)起到了至關(guān)重要的作用。因此，各大醬香型白酒企業(yè)對于窖面酒的生產(chǎn)都格外重視。

“曲乃酒之骨”，大曲的品質(zhì)對于窖面酒來說更加重要，因為在窖面糟醅培植的過程中使用了更多的曲粉，目的是生產(chǎn)出窖面風(fēng)格突出的窖面酒。大量研究表明，關(guān)于醬香型白酒高溫大曲中能產(chǎn)醬香風(fēng)味的微生物大多是芽孢桿菌屬。由于芽孢桿菌生長代謝的作用，促進(jìn)了美拉德反應(yīng)產(chǎn)生大量醬香物質(zhì)[4-5]。

隨著微生物技術(shù)的發(fā)展，近年來越來越多的釀酒企業(yè)重視利用微生物菌劑來提升產(chǎn)質(zhì)量，取得了一些成果。例如趙希玉等從茅臺酒釀造微生物分離得到6株產(chǎn)醬香芽孢桿菌屬，將其制成細(xì)菌曲后，可生成香草醛、阿魏酸、丁香酸等組成醬香型白酒的香味物質(zhì)，有助于提高或補(bǔ)充大曲醬香型白酒中的香氣物質(zhì)成分[6]。顏林春等[7]從醬香型高溫大曲中篩選到10株芽孢桿菌功能菌，經(jīng)純種液體培養(yǎng)后加入制曲原料制成強(qiáng)化高溫大曲，強(qiáng)化高溫大曲符合酒廠一級大曲質(zhì)量指標(biāo)，并且強(qiáng)化大曲中2,3,5,6-四甲基吡嗪含量明顯高于普通大曲。

本研究計劃從“國臺酒-細(xì)菌菌種庫”中篩選出功能芽孢桿菌屬的菌株，進(jìn)而利用這些菌株制作菌劑，強(qiáng)化到窖面糟醅的培植過程中，研究其代謝產(chǎn)香能力，評判窖面酒質(zhì)量是否提高，初步探索決定窖面酒質(zhì)量的物質(zhì)成因，最終確定功能菌株和強(qiáng)化工藝，用以提高窖面酒的質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

菌種：“國臺酒-細(xì)菌菌種庫”中保藏的芽孢桿菌屬的菌株，包含枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、耐熱芽孢桿菌、索諾拉沙漠芽孢桿菌在內(nèi)的5個種，共計18株菌。

材料：小麥，酒廠提供。

試劑：氯化鈉，分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；乙醚，分析純，天津威晨化學(xué)試劑科貿(mào)有限公司；蛋白胨、酵母浸粉，生化試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；2-乙基丁酸，色譜純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

儀器設(shè)備：生化培養(yǎng)箱，德國Binder公司；Thermo GC-MS Trace 1300氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；色譜柱（HPFFAP，30 m×0.53 mm，1 μm），美國安捷倫公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市天宇實驗儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋，上海森信實驗儀器有限公司；立式滅菌器，山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；磁力攪拌器，天津布斯特科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 功能微生物篩選和菌劑制作

（1）LB培養(yǎng)基的配制：蛋白胨10 g，酵母浸出汁5 g，NaCl 10 g，水1000 mL，調(diào)pH7.5，121 ℃高壓滅菌20 min。

（2）一級種子培養(yǎng)：從篩選得到的芽孢桿菌斜面挑取少許菌體，轉(zhuǎn)接至250 mL三角瓶，每個瓶中裝有50 mL的LB液體培養(yǎng)基。搖床37℃，200 r/min條件下培養(yǎng)至生長穩(wěn)定期。

（3）二級種子培養(yǎng)：將篩選得到的芽孢桿菌培養(yǎng)液50 mL一分為二，分別轉(zhuǎn)接至1000 mL大三角瓶，內(nèi)裝有250 mL LB液體培養(yǎng)基，即接種量為10%，37℃，180 r/min條件下培養(yǎng)至生長穩(wěn)定期。

（4）固體菌劑培養(yǎng)：稱取22.5 kg小麥潤糧（8%加水量，熱水）3 h，然后進(jìn)行磨碎和裝盆。每個不銹鋼盆中裝入的磨碎小麥量為2.6 kg，加入800 mL水（補(bǔ)水量即31%）。分別將篩選出的芽孢桿菌的二級種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到對應(yīng)的不銹鋼盆中，不銹鋼盆上覆蓋紗布和塑料袋，進(jìn)行固體培養(yǎng)。步驟為：第1天在培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24 h；第2天將培養(yǎng)溫度調(diào)整至45℃，持續(xù)2 d；發(fā)酵第4天進(jìn)行翻拌，持續(xù)3 d；第7天將培養(yǎng)溫度調(diào)整至52℃；第8天將培養(yǎng)溫度調(diào)整至57℃；第9天將培養(yǎng)溫度調(diào)整至62℃。發(fā)酵過程中觀察發(fā)酵情況，第10天或11天時大致完成菌劑培養(yǎng)。

（5）感官評價和菌株篩選：在結(jié)束菌劑培養(yǎng)之后，將菌劑磨成粉，然后利用五分制打分法進(jìn)行感官初評和復(fù)評，從以下感官特征進(jìn)行評價，共分為6類：醬香味、酸味、焦香味、氨臭味、糊味和咸腥味。篩選出醬香強(qiáng)度大，且整體風(fēng)格明顯的樣品，挑選其為出發(fā)菌株，作為生產(chǎn)應(yīng)用菌株。同時，檢測篩選出的菌株的酸度、糖化力、中性蛋白酶活力和酸性蛋白酶活力指標(biāo)。

（6）菌劑生產(chǎn)應(yīng)用：將篩選出的功能芽孢桿菌制作的菌劑等比例混合后應(yīng)用于2017年貴州國臺酒業(yè)三輪次窖面酒的生產(chǎn)中，選取了一車間2班6號窖池和二車間10班6號窖池為試驗窖池，其他窖池均為對照窖池。應(yīng)用功能芽孢桿菌制作的固態(tài)菌劑（等比例混合）（共10 kg）培植窖面糟醅，菌劑與普通曲粉的混合比例為1∶5，跟蹤發(fā)酵生產(chǎn)進(jìn)程，評定窖面酒質(zhì)量的差異。

1.2.2 測定及數(shù)據(jù)分析方法

（1）理化指標(biāo)檢測方法

糟醅酸度、還原糖和淀粉含量：酸度測定采用酸堿滴定法、糖分和淀粉含量采用斐林滴定法，具體檢測方法參見沈怡方編著的《白酒生產(chǎn)技術(shù)全書》[8]。

酒精度、總酯、總酸：參照GB/T 10345—2007《白酒分析方法》[9]。

蛋白酶活力檢測：Folin法[10-11]。（2）揮發(fā)性物質(zhì)檢測方法

Ⅱ菌劑揮發(fā)性物質(zhì)組成檢測采用頂空固相微萃取結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用儀（SPMEGC-MS）的方法，具體檢測條件為：

A.樣品前處理方法

稱取5 g粉碎后的大曲樣品，置于20 mL頂空瓶內(nèi)，加入5 mL飽和NaCl溶液、50 μL內(nèi)標(biāo)溶液（2-乙基丁酸），放入磁力攪拌轉(zhuǎn)子，輕輕搖勻。置于50℃水浴中平衡10 min，插入50/30 μm萃取頭攪拌吸附30 min，最后于進(jìn)樣口處解吸5 min。

B.儀器檢測條件

GC條件：進(jìn)樣口溫度250℃，載氣He，柱流速1.5mL/min，吹掃流量：1.0mL/min，總流量25mL/min，分流比10∶1；色譜柱：HP-FFAP（50 m×0.25 mm，0.2 μm）；升溫程序：40℃保持2 min，以3.5℃/min升溫至90℃，以5℃/min升溫至230℃保持10 min。溶劑延遲0.1 min。

MS條件：電子電離源(EI)，電子轟擊能量70 eV，離子源溫度250℃，傳輸線溫度250℃；全掃描模式。

Ⅱ基酒揮發(fā)性物質(zhì)組成檢測

A.樣品前處理方法

取5 mL白酒樣品，15 mL超純水，50 μL GCMS內(nèi)標(biāo)溶液（2-乙基丁酸），混勻，然后加入2.0 mg的NaCl，2 mL的乙醚，渦旋振蕩至NaCl完全溶解；靜止20 min后，取上層作為供試品。

B.儀器檢測條件

GC條件：進(jìn)樣口溫度250℃，載氣He，柱流速1.5mL/min，吹掃流量：1.0mL/min，總流量25mL/min，分流比10∶1；色譜柱：HP-FFAP（50 m×0.25 mm，0.2 μm）；升溫程序：40 ℃保持2 min，以3.5 ℃/min升溫至90℃，以5℃/min升溫至230℃保持10 min。溶劑延遲0.1 min。

MS條件：電子電離源(EI)，電子轟擊能量70 eV，離子源溫度250℃，傳輸線溫度250℃；全掃描模式。

（3）數(shù)據(jù)分析方法

GC-MS數(shù)據(jù)通過AMDIS軟件導(dǎo)出，各個窖面酒樣GC-MS總離子流圖中出峰物質(zhì)的相對峰強(qiáng)度為出峰物質(zhì)的峰面積比上內(nèi)標(biāo)物2-乙基丁酸的出峰面積。不同酒樣之間的差異性分析采用SIMCA 11.5軟件進(jìn)行PLS-DA模型分析，尋找解釋窖面酒質(zhì)量差異成因的物質(zhì)組分（VIP得分大于1.2）。

2 結(jié)果與分析

2.1 功能微生物篩選結(jié)果

對18株待測芽孢桿菌菌株進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)之后，將得到的菌劑磨成粉，然后由3名具有多年生產(chǎn)經(jīng)驗的人員進(jìn)行感官初評和復(fù)評，通過打分法，從以下感官特征對菌劑進(jìn)行評價，共分為6類：醬香味、酸味、焦香味、氨臭味、糊味和咸腥味。篩選出醬香強(qiáng)度大，且整體風(fēng)格明顯的樣品，挑選其為出發(fā)菌株，作為生產(chǎn)應(yīng)用功能菌株。18株出發(fā)菌株對應(yīng)的菌劑感官得分結(jié)果見圖1。

圖1 功能菌株篩選——感官數(shù)據(jù)雷達(dá)圖

由圖1可知，在18株菌株中，A29、A27、B12和M2這4株菌株其發(fā)酵產(chǎn)物在醬香和整體風(fēng)格兩項感官特征打分最高，香氣特征最明顯?？紤]到目前尚沒有評價窖面酒的質(zhì)量高低的理化或物質(zhì)成分指標(biāo)，所以，本研究采用感官評價的方法篩選出可能提高窖面酒質(zhì)量的功能菌株，繼而再進(jìn)行生產(chǎn)驗證。

A29、A27、B12和M2這4株菌株表現(xiàn)出了更為突出的感官特征，進(jìn)而我們考察了這4株功能菌株的理化指標(biāo)性能，結(jié)果見表1。

由表1可知，篩選出的4株功能菌株，其理化特征數(shù)據(jù)并不突出，糖化力很低，蛋白酶的活性也不高。有些研究報道稱“產(chǎn)醬香功能菌”，一般代謝產(chǎn)蛋白酶的活力也較高[4，5，12]，而本研究中的功能菌株表現(xiàn)為蛋白酶活力不高，但醬香特征非常明顯。因此，我們認(rèn)為不是所有的“產(chǎn)醬香功能菌”都具有較高蛋白酶活性。另外，也可能是本研究模擬大曲高溫發(fā)酵的固態(tài)發(fā)酵方式，蛋白酶在高溫階段活力降低的原因。

由于篩選出的這4株功能菌株，醬香特征和整體風(fēng)格特征明顯，本研究考察了4株功能菌株對應(yīng)的菌劑的揮發(fā)性物質(zhì)成分情況。結(jié)果表明，揮發(fā)性物質(zhì)中含量較多的物質(zhì)分別為四甲基吡嗪、丁酸、2,6-雙（1,1-二甲基乙基）-4-羥基-4-甲基-2,5-環(huán)己二烯-1-酮、苯甲醛、乙偶姻和3-甲基丁酸。A27、M2、B12這3株菌株代謝產(chǎn)四甲基吡嗪的能力非常強(qiáng)，均占到各自發(fā)酵菌劑中所有代謝產(chǎn)物的45%以上。其中，M2代謝產(chǎn)四甲基吡嗪能力最強(qiáng)，達(dá)到了所有代謝產(chǎn)物的84%。此結(jié)果初步說明，四甲基吡嗪是決定菌劑的醬香特征和整體風(fēng)格的重要物質(zhì)之一，與以往的文獻(xiàn)報道一致[13-15]。功能菌株揮發(fā)性物質(zhì)代謝結(jié)果見圖2。

表1 功能菌株理化指標(biāo)結(jié)果

圖2 功能菌株揮發(fā)性物質(zhì)代謝結(jié)果

表2 試驗窖窖面培植的生產(chǎn)工藝原始記錄

2.2 功能微生物菌劑的生產(chǎn)應(yīng)用

將篩選出的4株功能芽孢桿菌菌株A27、A29、M2、B12制作的菌劑等比例混合后應(yīng)用于2017年酒業(yè)窖面酒的二輪次生產(chǎn)中，選取一車間2班6號窖池和二車間10班6號窖池為試驗窖池；再選取一車間2班6個其他窖池作為對照窖池；二車間10班6個其他窖池作為對照窖池。應(yīng)用該4株產(chǎn)醬香微生物制作的固態(tài)菌劑（等比例混合）（共10 kg）培植窖面，等量替代原生產(chǎn)曲粉，即實驗窖池采用10 kg微生物菌劑和50 kg普通曲粉，混入窖面糟醅中，跟蹤發(fā)酵生產(chǎn)進(jìn)程。對照窖培植窖面時完全采用普通曲粉（60 kg）。二輪次試驗窖窖面培植的現(xiàn)場生產(chǎn)及其生產(chǎn)工藝原始記錄見表2。

在實驗過程中，我們跟蹤了實驗窖池和對照窖池在生產(chǎn)發(fā)酵過程中糟醅的理化指標(biāo)的變化，即跟蹤了入窖糟醅和出窖糟醅的酸度、糖分、水分和淀粉含量的變化。結(jié)果表明，添加了微生物菌劑的實驗窖糟醅理化指標(biāo)與對照窖糟醅的理化指標(biāo)非常接近，由于數(shù)據(jù)較多，本文未展示。檢測結(jié)果說明通過人工強(qiáng)化微生物菌劑的方式，雖然改變了發(fā)酵前初始微生物種群的組成，但是在發(fā)酵結(jié)束后，并不會影響發(fā)酵指標(biāo)的變化，我們推測，強(qiáng)化的微生物菌劑是改變了醬香風(fēng)味物質(zhì)或前體物質(zhì)含量，進(jìn)一步影響了窖面酒的感官質(zhì)量。

在發(fā)酵結(jié)束后，本研究重點(diǎn)關(guān)注了實驗窖池和對照窖池生產(chǎn)的窖面酒質(zhì)量的差異，首先對比了總酸、總酯及酸酯比的情況，結(jié)果見表3。

由表3能夠看出，添加了微生物菌劑的實驗窖窖面酒與利用普通曲粉生產(chǎn)的對照窖窖面酒樣，在總酸、總酯和酸酯比這些指標(biāo)上非常接近。進(jìn)一步說明了微生物菌劑在發(fā)酵過程中的作用是改變了窖面酒中的微量代謝物質(zhì)的含量，而不是總酸和總酯這些骨架類物質(zhì)的含量。

表3 窖面酒理化指標(biāo)結(jié)果

本研究對實驗窖窖面酒和對照窖窖面酒，共計14個酒樣的質(zhì)量進(jìn)行感官評定，利用打分法進(jìn)行感官初評和復(fù)評，感官評價的結(jié)果見表4。

由表4能夠看出，實驗窖窖面酒（JM-3-2-6和JM-3-10-6）的感官得分要明顯高于對照窖窖面酒的感官得分，主要體現(xiàn)在曲香特征和整體風(fēng)格特征上的得分高。說明添加了微生物菌劑能夠有效提高這兩種感官特征。以上結(jié)果表明，在醬香型白酒窖面酒的生產(chǎn)過程中，應(yīng)用4株強(qiáng)化功能芽孢桿菌菌株A27、A29、M2、B12制作的菌劑，能夠有效提高窖面酒的質(zhì)量。

本研究更關(guān)心的是哪些微量物質(zhì)決定了窖面酒質(zhì)量的差異，現(xiàn)有文獻(xiàn)報道均未見這方面的研究成果。因此，我們對生產(chǎn)出來的實驗窖窖面酒和對照窖窖面酒進(jìn)行了揮發(fā)性微量物質(zhì)成分的檢測。不同酒樣之間的差異性分析采用SIM-CA 11.5軟件進(jìn)行PLS-DA模型分析，尋找解釋窖面酒質(zhì)量差異成因的物質(zhì)組分（VIP得分大于1.2），見圖3。

由圖3能夠清楚的看出，利用PLS-DA模型分析，能夠?qū)①|(zhì)量不同的窖面酒進(jìn)行分類。圖3中黑色（以class 1表示）的樣品代表感官得分較高的酒樣，得分都在67分以上；而圖3中紅色（以class 2表示）的樣品代表感官得分較低的酒樣，基本都低于67分。VIP得分大于1.2的物質(zhì)有：2-丁酮、硬脂酸乙酯、十四碳烯酸乙酯、丙酸乙酯、2-甲基-1-丙醇、苯甲醛、1-己醇、十七烷酸乙酯、2-庚酮、正丙醇、異戊醇、乙酸異丁酯、乙酸苯乙酯、2-甲基丙酸和月桂酸乙酯。以上這15種物質(zhì)可能是決定窖面酒質(zhì)量差異的關(guān)鍵因子，但目前的數(shù)據(jù)樣本還比較少，需要未來在大量數(shù)據(jù)分析的基礎(chǔ)上，結(jié)合多元統(tǒng)計的方法，進(jìn)一步確定哪些物質(zhì)組分是關(guān)鍵因子，從而指導(dǎo)生產(chǎn)或勾兌。

表4 窖面酒感官評分結(jié)果

圖3 不同質(zhì)量窖面酒偏最小二乘法判別分析

在以上基礎(chǔ)上，我們確定了利用微生物菌劑提高醬香白酒窖面酒質(zhì)量的工藝流程，見圖4。

圖4 強(qiáng)化窖面菌劑工藝流程圖

3 結(jié)論

本研究根據(jù)發(fā)酵產(chǎn)物感官情況篩選出了4株功能芽孢桿菌菌株，并將這4株菌株制作成了微生物菌劑，在窖面酒生產(chǎn)過程中實際應(yīng)用。結(jié)果表明添加了微生物菌劑的實驗窖窖面酒與利用普通曲粉生產(chǎn)的對照窖窖面酒樣，在總酸、總酯和酸酯比指標(biāo)上非常接近。品酒結(jié)果顯示，實驗窖窖面酒的感官得分要明顯高于對照窖窖面酒的感官得分，主要體現(xiàn)在曲香特征和整體風(fēng)格特征上。通過對窖面酒樣的揮發(fā)性物質(zhì)成分分析，以及數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，初步確定了決定窖面酒質(zhì)量差異成因的物質(zhì)組分為2-丁酮、硬脂酸乙酯、十四碳烯酸乙酯、丙酸乙酯、2-甲基-1-丙醇、苯甲醛、1-己醇、十七烷酸乙酯、2-庚酮、正丙醇、異戊醇、乙酸異丁酯、乙酸苯乙酯、2-甲基丙酸和月桂酸乙酯。最終，本研究確定了利用微生物菌劑提高醬香白酒窖面酒質(zhì)量的工藝流程。