黃海鋒，葛勇勝，劉文斌，馬金良

肝癌以病死率高[1]、生存周期短、復(fù)發(fā)率高為顯著特征，手術(shù)治療的局限性造成治療效果較差，因而手術(shù)之外新的治療方法對提高患者生存率具有重要意義。全基因組測序分析表明多數(shù)基因被轉(zhuǎn)錄為非編碼RNA(non-coning RNAs,ncRNAs)，主要包括微小RNA(microRNAs)和長的非編碼RNA(long non-coning RNAs, lncRNAs)[2]。lncRNAs是一類長度大于200個核苷酸的非編碼單鏈RNA，多數(shù)lncRNAs的轉(zhuǎn)錄高度保守，在細胞內(nèi)受到嚴格的調(diào)控。lncRNAs在腫瘤細胞的增殖、侵襲等生物學(xué)過程中具有明確的調(diào)節(jié)作用。lncRNA GAS5(growth arrest-specific transcript 5，GAS5)是由mTOR通路控制穩(wěn)定翻譯的5’-TOP RNA，在人T淋巴細胞生長停滯中起重要作用的非編碼RNA[3],最先從nih3t3型老鼠的纖維母細胞中分離而來[4]。GAS5在包括結(jié)直腸癌[5]、乳腺癌[6]、宮頸癌[7]、非小細胞肺癌[8-9]、胰腺癌、前列腺癌[10-11]等多種腫瘤細胞中表達，腫瘤細胞中低表達預(yù)示較差的生存周期[6,9,12]，但不同腫瘤GAS5的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制具有明顯差異，在前列腺癌中通過靶向控制P27Kip1作用調(diào)控細胞增殖[13]，在神經(jīng)母細胞瘤中通過激活BRCA1和p53來調(diào)節(jié)細胞周期和凋亡[14]，在結(jié)直腸癌中作為腫瘤抑制因子抑制白介素-10和血管內(nèi)皮生長因子表達來影響細胞增殖和遷移[5]。在肝癌方面，其表達調(diào)控機制研究甚少。該研究通過檢測GAS5表達水平變化以及在細胞周期調(diào)控中具有重要作用的相關(guān)蛋白檢測，來分析其對肝癌細胞系增殖、遷移、侵襲作用，并進一步推測其可能調(diào)控的靶點，為肝癌的靶向治療尋求新的靶點。

1 材料與方法

1.1病理標本及主要實驗試劑收集安徽省立醫(yī)院肝臟外科2016年6月～12月肝癌組織及對應(yīng)遠癌旁組織(距癌組織邊緣>2 cm)共20例，術(shù)后病理均為肝細胞性肝癌，病理標本取下直接保存于-80 ℃的液氮中保存?zhèn)溆谩＝M織研究用途均告知家屬并予以簽署同意書。TRIzol試劑購自美國Life technogies 公司；DNA標記試劑盒QuantiNova SyBr Green PCR Kit購自德國Qiagen公司 ；反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAidTMfirst Strand cDNA Synthesis購自美國Thermo Scientific公司;細胞周期依賴性蛋白激酶6(cell division protein kinase 6，CDK6)一抗購自美國Bioss公司；細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)一抗及細胞增殖檢驗CCK-8試劑盒(cell counting Kit-8,CCK-8)購自美國bio-teche公司；細胞因子E2F-1一抗購自上海瑞齊實業(yè)科技有限公司；肝癌HepG2細胞株購自上海細胞庫。

1.2實驗方法

1.2.1組織RNA提取及qRT-PCR 組織RNA經(jīng)TRIzol試劑溶解提取，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備成cDNA，以β-actin作為內(nèi)參，人β-actin擴增子的大小為180 bp，正向引物：5’-GGGAAATCGTGCGTGACATTAAGG-3’，反向引物：5’-CAGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG -3’；人 GAS-5擴增子大小為115 bp，正向引物：5’-CACAACAAGCAAGCATGCAG-3’，反向引物：5’-GAGGATCACTTGAGCCCAGA-3’。反應(yīng)條件：95 ℃、2 min，95 ℃、5 s，60 ℃、10 s，重復(fù)40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt比較分析基因表達。

1.2.2GAS5質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實驗 NCBI上查找GAS5的序列，根據(jù)目的基因設(shè)計合成一條具有GAS5的干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)組(siRNA-GAS5組)及一條對照siRNA組(siRNA-NC組)，同時設(shè)置空轉(zhuǎn)染組(Con組)， siRNA-GAS5轉(zhuǎn)染前1天，將2×105個/ml細胞接種于培養(yǎng)板中，每孔中加入約500 μl無抗生素的培養(yǎng)基。取1 μl/孔lipo2000，用50 μl opti-MEM無血清培養(yǎng)基稀釋，并室溫孵育5 min。取2 μl siRNA，以50 μl opti-MEM無血清培養(yǎng)基稀釋，混勻。兩種液體輕輕混勻，室溫靜置20 min。加入含有細胞及培養(yǎng)液的孔中，混勻。轉(zhuǎn)染6 h后，換為含血清的完全培養(yǎng)基。細胞收集后PCR檢測確認GAS5表達下降后，細胞予以備用。

1.2.3細胞劃痕實驗 取對數(shù)生長周期細胞，以2×105個/ml、每孔接種2 ml細胞液，過夜，愈合度100%時，棄去培養(yǎng)基，開始劃線。劃線與板底橫線交叉點即為固定觀察點；劃痕后按0、48 h時間點拍照。測定各組細胞在0、48 h觀察點的劃痕寬度，計算遷移率(%)=(0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.2.4Transwell實驗 Matrigel膠與DMEM培養(yǎng)基按1 ∶9混勻制成稀釋液。小室濾膜均勻涂抹50 μl稀釋液，37 ℃、5% CO2恒溫箱滯留2 h,取出涂抹DMEM培養(yǎng)基50 μl 恒溫箱滯留2 h。取3組培養(yǎng)24 h細胞，0.25%胰酶消化，1 000 r/min離心 5 min， DMEM 培養(yǎng)液得下層細胞，計數(shù)，細胞密度調(diào)為1×106個/ml。上室加下層細胞液各200 μl，下室加600 μl 30% FBS的DMEM培養(yǎng)液，每組細胞設(shè)3個復(fù)孔。取出小室，上室培養(yǎng)液吸除，PBS浸潤2 min，共3次，擦凈上室表面Martrigel膠，95%酒精固定30 min，結(jié)晶紫染色15 min，晾干。拍照、計數(shù)：200倍顯微鏡下計算出穿膜細胞均數(shù)。

1.2.5CCK-8檢測細胞增殖 待檢測細胞計數(shù)，并度鋪于96孔板。確定細胞貼壁后，繼續(xù)培養(yǎng)2～4 h使其貼壁緊密。WST-8混合液儲存液用PIPES緩沖液稀釋10倍到使用濃度。96孔板每個孔加入10 μl CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育0.5～4 h。顯色反應(yīng)后，加入終止液10 μl，終止反應(yīng)，酶標儀450 nm測定吸光度，每個樣本做3個復(fù)孔實驗。根據(jù)OD450值繪制0、24、48、72、96 h增殖曲線。

1.2.6Western blot檢測 組織樣品稱重100 mg，加入RIPA細胞裂解液1 ml(內(nèi)含1 mmol/L PMSF),提取組織總蛋白。蛋白按照1 ∶4加入5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，沸水浴10 min變性，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，一抗、二抗孵育，使用ECL超敏發(fā)光試劑盒來檢測蛋白。細胞實驗方案同組織實驗。

2 結(jié)果

2.1GAS5、CDK6在肝癌組織、癌旁組織表達情況20對肝癌及對應(yīng)癌旁組織qRT-PCR和Western blot實驗證實GAS5和CDK6在肝癌和癌旁組織中均出現(xiàn)表達，qRT-PCR結(jié)果表明GAS5在肝癌組織相對表達量(0.49±0.47)低于癌旁組織(1.12±0.53),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=16.22,P<0.01)，見圖1，CDK6在80%(16/20)的肝癌組織出現(xiàn)高表達，表達明顯高于癌旁組織(圖2)。

圖1 GAS5在癌組織與癌旁組織相對表達量對比

圖2 Western blot檢測20組肝癌組織與癌旁組織CDK6表達情況

2.2GAS5對HepG2細胞侵襲、遷移、增殖影響與轉(zhuǎn)染siRNA-GAS5組(60.0±5.00)比較，siRNA-NC組(29.66±5.03)和Con組(28.33±9.07)的HepG2細胞劃痕實驗結(jié)果表明遷移能力差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=21.76，P<0.01)；Con組與siRNA-NC組差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (圖3)。Transwell實驗表明，與siRNA-NC組(38.7±5.69)和Con組(32.0±10.1)比較, 轉(zhuǎn)染siRNA-GAS5組(61.57±7.60)HepG2細胞形態(tài)差異大，穿過Martrigel膠細胞數(shù)增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=8.80，P<0.05), 而siRNA-NC組與Con組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖4)。CCK-8檢測干擾后的細胞在450 nm OD值表明，隨時間變化均出現(xiàn)吸光度增長趨勢，在96 h測量結(jié)果顯示，與siRNA-GAS5組(0.76±0.07)比較，siRNA-NC組(0.54±0.02)和Con組(0.56±0.03)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=14.21，P<0.01)，siRNA-NC組和Con組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖5)。

圖3 經(jīng)siRNA干擾后HepG2細胞遷移率比較

A：siRNA-GAS5組；B：siRNA-NC組；C：Con組；1:0 h；2:48 h；與siRNA-NC組比較：**P<0.01；與Con組比較：##P<0.01

圖4 經(jīng)siRNA的HepG2細胞侵襲性比較 ×200

A：siRNA-GAS5組24 h侵襲圖；B：siRNA-NC組24 h侵襲圖；C：Con組24 h侵襲圖；與siRNA-GAS5組比較：*P<0.05；與Con組比較：#P<0.05

圖5 轉(zhuǎn)染siRNA后HepG2細胞OD450值比較

2.3經(jīng)siRNA-GAS5轉(zhuǎn)染后的HepG2細胞周期相關(guān)蛋白表達影響經(jīng)siRNA-GAS5質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的HepG2細胞內(nèi)Cyclin D1、CDK6、E2F-1 mRNA相對表達量均出現(xiàn)上調(diào)，與siRNA-NC組和Con組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1、圖6。

2.4GAS5的下調(diào)對HepG2細胞周期變化影響經(jīng)GAS5-siRNA干擾48 h后的G1、S、G2期細胞百分比變化(39.73±3.21、43.03±4.72、16.25±8.69vs50.51±4.98、35.40±5.28、17.10±4.25)。由各細胞百分比變化可知，與siRNA-NC組比較，siRNA-GAS5組細胞周期在G1期出現(xiàn)降低，S期出現(xiàn)升高，siRNA-GAS5組與siRNA-NC組在G1期與S期發(fā)生明顯轉(zhuǎn)變(圖7)。

表1 轉(zhuǎn)染siRNA及空白組相關(guān)蛋白mRNA表達量

與siRNA-NC組比較：**P<0.01；與Con組比較：##P<0.01

圖6 siRNA干擾后的HepG2細胞周期相關(guān)蛋白表達及相應(yīng)mRNA相對表達量比較

A: Western blot檢測CDK6、Cyclin D1、E2F-1 蛋白表達; B: CDK6 mRNA相對表達量; C: Cyclin D1 mRNA相對表達量; D: E2F-1 mRNA相對表達量;1：siRNA-NC組；2：Con組；3：siRNA-GAS5組；與siRNA-NC組比較：**P<0.01；與Con組比較：##P<0.01

圖7 GAS5參與細胞周期調(diào)控

A：流式細胞儀檢測siRNA-NC轉(zhuǎn)染的周期計數(shù)圖；B：流式細胞儀檢測siRNA-GAS5轉(zhuǎn)染的周期計數(shù)圖；C：siRNA-GAS5和siRNA-NC轉(zhuǎn)染后GAS5相對表達量；D：經(jīng)siRNA-GAS5與siRNA-NC轉(zhuǎn)染48 h各周期細胞百分比；與siRNA-GAS5組比較：**P<0.01

3 討論

近年來，已發(fā)現(xiàn)多種lncRNAs在細胞功能調(diào)節(jié)上具有重要作用，研究[6]表明GAS5具有抑制小膠質(zhì)細胞M2的極化以及加劇了脫髓鞘作用。GAS5調(diào)控TGF-β介導(dǎo)的平滑肌細胞分化通過結(jié)合RNA-smad實現(xiàn)[11]；GAS5是一個參與細胞生物調(diào)控的lncRNA,通過與E2F1相互作用和引誘其與P27Kip1啟動子結(jié)合來抑制前列腺癌增殖[15]。其主要在腫瘤抑制和致癌基因表達調(diào)控方面發(fā)揮作用，這些實例充分說明GAS5可作為腫瘤進展過程中重要的功能性調(diào)控因子，其異常表達參與腫瘤相關(guān)蛋白差異性表達促使腫瘤發(fā)生。

多數(shù)腫瘤發(fā)生發(fā)展是因GAS5在癌組織中出現(xiàn)下調(diào)所致，例如乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌、非小細胞肺癌等。本研究首先對肝癌組織與其對應(yīng)的癌旁組織PCR檢測結(jié)果顯示GAS5表達下降，前期實驗選取肝癌表型中常見的HepG2細胞，經(jīng)PCR檢測顯示其GAS5表達量較正常肝細胞明顯下調(diào)，為探討GAS5對HepG2細胞增殖遷移能力及其對HepG2細胞周期影響作用，本研究對HepG2細胞進行siRNA-GAS5干擾實驗，PCR檢測干擾后HepG2出現(xiàn)GAS5明顯下調(diào)的細胞再分別進行細胞劃痕遷移實驗、Transwell實驗以及CCK-8檢測干擾后細胞增殖OD值，實驗顯示經(jīng)GAS5-siRNA干擾的HepG2細胞株較siRNA-NC組、Con組的HepG2細胞，其細胞的遷移能力、侵襲能力、增殖能力都出現(xiàn)增強，對于siRNA-NC與未經(jīng)siRNA干擾的HepG2相比，其三者能力為出現(xiàn)明顯改變。說明GAS5在肝癌細胞生物學(xué)特性方面具有重要的抑制腫瘤增殖侵襲作用。GAS5可作為一個腫瘤抑癌因子抑制肝癌細胞體外侵襲轉(zhuǎn)移。

在細胞周期的調(diào)控中GAS5同樣具有明顯的抑制或促進凋亡作用。體外對宮頸癌細胞增殖研究中表明，上調(diào)的GAS5抑制細胞增殖、遷移和凋亡是通過降低細胞內(nèi)miR-196a和miR-205水平[10]；此外GAS5的表達同樣在前列腺癌中出現(xiàn)低表達，GAS5的異位表達抑制了細胞增殖和調(diào)控細胞周期停留在G0/G1期，GAS5-siRNA干擾下調(diào)GAS5時又促進G1-S相過度。這些研究證實在腫瘤進展期中，GAS5通過不同的調(diào)控通路調(diào)控細胞周期來抑制腫瘤細胞進展已十分確切。本研究通過MTT實驗檢測經(jīng)GAS5-siRNA干擾下調(diào)GAS5的HepG2細胞，相對于未進行轉(zhuǎn)染和siRNA-NC轉(zhuǎn)染組的HepG2細胞來說，其細胞周期發(fā)生明顯改變，處于 G0/G1期細胞減少，而S期細胞明顯增多，證實在肝癌細胞內(nèi)的GAS5的水平含量與細胞周期改變相關(guān)，這和宮頸癌、前列腺癌的細胞周期研究得到相似的結(jié)果，但不同細胞內(nèi)因其細胞分化方向不同，細胞生物特性有所差異，其表達的功能性蛋白不同，GAS5在不同細胞內(nèi)對細胞周期的調(diào)控機制也不盡不同。

研究[15]表明與細胞周期調(diào)控密切相關(guān)的Ras下游通路的周期蛋白依賴性激酶系統(tǒng)、Cyclin D蛋白家族與消化系統(tǒng)中的胃癌和胰腺癌有密切的關(guān)系。通過CDK6和Cyclin D1以及其下游調(diào)控的E2F-1研究，推斷GAS5參與細胞周期調(diào)控的潛在機制。Western blot檢測肝癌和癌旁組織表明CDK6與GAS5表達水平呈現(xiàn)負相關(guān)關(guān)系,二者間可能存在潛在的直接或間接調(diào)控關(guān)系，進一步對經(jīng)siRNA-GAS5轉(zhuǎn)染的HepG2細胞Cyclin D1、CDK6、E2F-1蛋白進行Western blot與PCR檢測，低表達GAS5的HepG2細胞中Cyclin D1、CDK6 、E2F-1均出現(xiàn)表達水平的上升， 細胞內(nèi)Cyclin D1蛋白出現(xiàn)異常表達，可能和GAS5通過Ras-MAPK途徑來激活Cyclin D1基因的轉(zhuǎn)錄有關(guān)，E2F-1蛋白水平上調(diào)證實GAS5同樣參與HepG2細胞細胞周期調(diào)控，這與Shan et al[15]研究相符。MTT結(jié)果驗證GAS5對細胞周期的調(diào)控主要在G1/S期轉(zhuǎn)變，這與細胞內(nèi)Cyclin D1通過與CDK6形成復(fù)合物激活底物pRb的磷酸化相關(guān)，pRb的磷酸化使得與pRb結(jié)合的組蛋白脫乙酰基蛋白(HDAC)破環(huán)，生成E2F-1明顯增加,E2F-1是細胞周期進展到S期所需細胞周期因子。HepG2細胞周期相關(guān)蛋白上調(diào)驗證其與GAS5表達密不可分。