孫福新

檸檬酸是一類三元羧酸，3-羥基- 3-羧基戊二酸，即枸櫞酸。作為生物體代謝的主要產(chǎn)物之一，檸檬酸大多存在于生物體果實(shí)中，目前逐漸被應(yīng)用于醫(yī)藥、食品及化工領(lǐng)域。檸檬酸全球消耗量正以每年7%的增長率增長，已躍居世界發(fā)酵產(chǎn)品產(chǎn)量的第二位。伴隨現(xiàn)代化生物技術(shù)的不斷發(fā)展與成熟，采用發(fā)酵法生產(chǎn)檸檬酸的技術(shù)及工藝條件已不斷成熟，并逐漸體現(xiàn)出簡(jiǎn)單便捷、生產(chǎn)效率高等優(yōu)勢(shì)，因此文章主要對(duì)檸檬酸的發(fā)酵工藝技術(shù)及其應(yīng)用做了系統(tǒng)化的研究。

檸檬酸的發(fā)酵過程

檸檬酸的發(fā)酵生產(chǎn)用到了多種類型的微生物，如曲霉類、酵母類、細(xì)菌類等，其中酵母類生產(chǎn)檸檬酸可利用不同類型的碳源微生物，尤其是利用解脂亞羅酵母生產(chǎn)檸檬酸已得到廣泛的應(yīng)用。然而，由于檸檬酸是一類能量代謝產(chǎn)物，因此需滿足代謝不平衡條件。其中，黑曲霉生產(chǎn)檸檬酸工藝以其產(chǎn)量高、操作簡(jiǎn)便、副產(chǎn)物少被得到廣泛的應(yīng)用，同時(shí)，對(duì)其發(fā)酵底無進(jìn)行了優(yōu)化，并將傳統(tǒng)誘變技術(shù)應(yīng)用于生產(chǎn)中，使得檸檬酸產(chǎn)量大大提升。

黑曲霉檸檬酸代謝途徑見下圖1所示，在EMP作用下可將六碳糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸，可進(jìn)一步被氧化脫羧生成乙?；虮幻摱趸忌刹蒗Ｒ宜?，二者進(jìn)一步可合成檸檬酸。作為TCA循環(huán)的代謝產(chǎn)物，檸檬酸的合成需借助酶的活性，而PEK受ATP及檸檬酸的抑制作用較強(qiáng)，但檸檬酸逐漸積累時(shí)，檸檬酸合成酶對(duì)乙酰的親和力也在逐步提升，因此，抑制烏頭酸水解酶的活性、破壞誘導(dǎo)機(jī)制是提升檸檬酸積累的關(guān)鍵措施。

發(fā)酵法生產(chǎn)檸檬酸的關(guān)鍵技術(shù)

檸檬酸發(fā)酵的方法?？傮w上講，檸檬酸的發(fā)酵方式包括了淺盤發(fā)酵工藝、固態(tài)及液態(tài)發(fā)酵工藝等類型，其中淺盤發(fā)酵工藝是檸檬酸發(fā)酵中最早的應(yīng)用形式，而固態(tài)發(fā)酵工藝可充分利用農(nóng)產(chǎn)品加工殘料，可降低生產(chǎn)成本并降低環(huán)境污染，但其肥料成分復(fù)雜，需進(jìn)一步研究相關(guān)提取工藝；液態(tài)發(fā)酵工藝具有產(chǎn)量大、自控性能好、效率高等優(yōu)勢(shì)，被廣泛應(yīng)用。

檸檬酸發(fā)酵的工藝條件。檸檬酸發(fā)酵過程中，菌種類型、環(huán)境條件均對(duì)其有著重要影響，一般地，檸檬酸發(fā)酵菌種多由腐爛水果中提取而來，經(jīng)過生物培養(yǎng)獲得優(yōu)良菌種，并嚴(yán)格控制發(fā)酵過程中的溫濕度、PH條件，以營造利于發(fā)酵的最佳條件。黑曲霉菌最佳發(fā)酵溫度條件為30±1℃，溫度偏低將影響發(fā)酵效率，而溫度偏高時(shí)將產(chǎn)生一系列污染性雜質(zhì)，甚至影響到霉菌的活性。而黑曲霉菌最佳發(fā)酵PH條件為3左右，易合成大量的檸檬酸并可有效抑制葡萄糖酸等雜質(zhì)的產(chǎn)生。此外，培養(yǎng)液中的含氧量也會(huì)影響到黑曲霉菌的活性，而隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行含氧量是逐漸下降的，因此可通過攪拌的方式避免含氧量降低對(duì)霉菌活性的影響。最后，采用物理或化學(xué)方法對(duì)所獲得的檸檬酸進(jìn)行提純處理，分離大分子蛋白雜質(zhì)，即可得到純度較高的檸檬酸。

檸檬酸發(fā)酵工藝新進(jìn)展。對(duì)于檸檬酸代謝途徑的研究表明，檸檬酸的合成速度受培養(yǎng)環(huán)境中二氧化碳的濃度影響較大，而在不同的二氧化碳濃度條件下，檸檬酸的發(fā)酵產(chǎn)量及速率也受到影響，因此二氧化碳既是代謝產(chǎn)物，又是生物合成反應(yīng)的必備原料。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，當(dāng)二氧化碳濃度高于0.90mol/L 時(shí)，將對(duì)微生物活性起到抑制作用。要想加快檸檬酸的發(fā)酵產(chǎn)量和質(zhì)量，需要將更多的二氧化碳固定反應(yīng)生成草酰乙酸，可借助基因工程提升丙酮酸的基因表達(dá)能力。此外，甲醇的存在可能會(huì)增加細(xì)胞對(duì)檸檬酸的滲透性，甲醇濃度的提升會(huì)影響到霉菌的活性，影響到檸檬酸的積累。

結(jié)論與展望

利用現(xiàn)代生物技術(shù)來提高檸檬酸發(fā)酵的產(chǎn)量和質(zhì)量具有較高的技術(shù)可行性，尤其是近年來基因工程、細(xì)胞工程以及基因誘變技術(shù)的發(fā)展，對(duì)于檸檬酸發(fā)酵工藝的優(yōu)化與發(fā)展提供了技術(shù)導(dǎo)向，開展檸檬酸生物合成途徑的研究，可以有效指導(dǎo)生物合成途徑的遺傳修飾，從而調(diào)節(jié)微生物對(duì)檸檬酸的生產(chǎn)，增加檸檬酸產(chǎn)量和提高檸檬酸的積累，也為提高其他有機(jī)酸產(chǎn)量的研究奠定了基礎(chǔ)。