申少斐， 齊永紅， 張 璇， 寇麗莎， 王德富， 牛顏冰*

(1.山西農業(yè)大學生命科學學院，山西太谷 030801；2.山西省果業(yè)工作站，山西太原 030001)

惡性腫瘤是嚴重威脅人類健康和生命的重大疾病之一。90%以上的腫瘤患者由于早期階段不能及時發(fā)現(xiàn)腫瘤轉移而錯失最佳治療時機，最終導致死亡[1 - 2]。腫瘤轉移是指具有轉移潛能的惡性腫瘤細胞從原發(fā)部位，經淋巴管、血管或體腔等途徑，到達其它部位繼續(xù)生長的過程[3 - 4]。傳統(tǒng)觀念將惡性腫瘤侵襲和轉移視為晚期事件，但近些年的研究認為其為早期事件[3]。因此，腫瘤侵襲和轉移的早期檢測對腫瘤治療和預后尤為重要，也是當前腫瘤患者的迫切期望。然而傳統(tǒng)的活體組織檢測不能在早期階段及時準確的預判腫瘤轉移[5 - 6]，因此，需要研究更為精準的檢測技術來獲得腫瘤轉移的訊息。

近來，已證實外周血液中循環(huán)腫瘤細胞(Circulating Tumor Cell，CTC)在腫瘤轉移過程中起關鍵作用,其數(shù)量的動態(tài)變化與腫瘤患者的臨床分期、腫瘤分化程度及預后密切相關[7 - 8]。將外周血中CTC表達水平作為腫瘤的“液體活檢”指標，不僅有助于預判腫瘤細胞是否發(fā)生轉移，便于及時治療，減少死亡發(fā)生；而且對惡性腫瘤的病情檢測、治療和預后等具有重要意義。然而常規(guī)的影像學、病理學和血清學等技術很難檢測到CTC，其主要瓶頸在于外周血中CTC含量極低，每10億個血液細胞中可能僅含有1～100個CTC[4 - 8]。所以，對其進行提前分選是必不可少的步驟。

近些年，微流控芯片技術已在生命分析研究中廣泛應用，其精確操控細胞的特點為CTC分選提供了新的有力工具[9 - 10]。目前分選技術主要分為兩大類：主動式分選技術和被動式分選技術[10]。主動式分選技術是指對分選對象提供額外的力場來實現(xiàn)細胞分選，具體分為電場分選[14]、磁場分選[15]、聲波分選[8,16]和光分選[17]等。主動式分選技術靈敏度高，穩(wěn)定性好，但同時伴隨著設備昂貴、操作難度大、芯片制作復雜、樣品處理通量低和容易對生物樣品產生傷害等缺點。不同于依賴外場作用力的主動式分選技術，被動式分選技術則完全依靠管道設計的特殊結構和流體動力學效應來實現(xiàn)細胞的分選。具體可分為擠壓流分選[18]、空間位阻分選[19]、親和性分選[20]和慣性微流分選[21]等。這些技術不需要額外的力場，使得芯片操作方法和芯片制造較為簡單。其中，慣性微流分選還展現(xiàn)出無需抗體標記(避免出現(xiàn)假陽性或假陰性結果)、處理通量高、集成性好、靈敏度高等優(yōu)點[22]。這些優(yōu)點使得慣性微流控技術為血液中CTC的高效分選研究提供了一種新的有力工具。

本研究將高通量的慣性微流方法與高回收率的微結構方法結合，發(fā)展了一種新型CTC分選微流控芯片。該裝置首先通過慣性微流分離區(qū)域移除大量的血液細胞，繼而通過等腰梯形微柱陣列欄桿進行二次分離，最終實現(xiàn)CTC的高通量、高回收率和高活性的分離。對比于傳統(tǒng)的過濾方法，本研究所設置的空間位阻結構還能夠有效地避免堵塞或擁堵問題，由于傳統(tǒng)過濾方法的流動方向是垂直于過濾結構的，容易導致一些較大的樣品不能穿過微結構而堵塞其流動路線[23]。而本芯片空間位阻區(qū)域中樣品的流動方向幾乎是與過濾欄桿平行的，極大地避免結構堵塞問題，為長時間穩(wěn)定過濾樣品和建立新型的細胞過濾方法提供了新的技術手段。

圖1 微流控芯片結構和功能機理圖。(A)微流控芯片實物圖；(B)灌注紅色染料后微流控芯片實物圖；(C)基于空間位阻和慣性微流對血液中循環(huán)腫瘤細胞進行分離的微流控芯片示意圖(芯片包括四種功能區(qū)域：過濾區(qū)域(a)、慣性聚集區(qū)域(b)、慣性分離區(qū)域(c)和空間位阻區(qū)域(d))；(D)慣性聚集區(qū)域功能詳細示意圖；(E)慣性分離區(qū)域功能詳細示意圖；(F)空間位阻區(qū)域功能詳細示意圖Fig.1 Structural and functional mechanism of the microfluidic device.(A) The photograph of the microfluidic chip;(B) The photograph of the microfluidic chip after injecting red dyes;(C) Schematic diagram of the designed microfluidic device for CTC isolation using steric hindrance and inertial microfluidics(The device comprised four functional regions:filter region(a) inertial focusing region(b) inertial separation region(c) and steric hindrance region(d));(D)Detailed schematic diagram of inertial focusing region;(E)Detailed schematic diagram of inertial separation region;(F)Detailed schematic diagram of steric hindrance region

1 實驗部分

1.1 主要儀器、試劑與材料

WS-400B-6NPP/LITEXI型旋轉涂膜儀(美國，Laurell Technologies公司)；LSP4-4A型微量注射泵(河北保定蘭格恒流泵有限公司)；DHG-9030A型鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)；BL-220H型分析天平(日本，島津公司)；H-8100型透射電子顯微鏡(日本，日立公司)。

聚二甲基硅氧烷(Polydimethyliloxane,PDMS)、固化劑購自美國Momentive Performance Materials公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(Foetal Bovine Serum,FBS)、胰蛋白酶和CellTracker活細胞熒光染料，均購自Invitrogen公司；L-谷氨酰胺購自Amresco公司；吖啶橙(Acridine Orange,AO)和碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)均購自Sigma公司；人源性乳腺癌細胞(MCF-7)和人源性宮頸癌細胞(HeLa)均購自中國科學院上海細胞庫；人全血，從一位健康的志愿者身上采集，加入含有抗凝血劑的試管中，保存在4 ℃冰箱中。光掩膜由深圳美精微光電有限公司制作；其他試劑均為國產分析純。本實驗所用細胞培養(yǎng)相關的溶液均進行無菌處理。

1.2 實驗方法

1.2.1芯片制備本實驗使用的微流控芯片采用AutoCAD(AutoCAD 2007,Autodesk Inc.)軟件繪制和設計，設計完成后由深圳美精微光電有限公司制備光掩膜。隨后利用陽性光刻膠(AZ 50XT)制作模板微結構，進一步采用模塑法中的軟刻技術制備微流控芯片，并采用PDMS部分固化法封接芯片。圖1A和1B清晰的展示出已制備完成的微流控芯片。

1.2.2細胞染色本實驗采用AO/PI雙染色法，分析兩種循環(huán)腫瘤細胞的活性，并利用細胞活性熒光染料(CellTracker Green CMFDA和CellTracker Orange CMRA)標記腫瘤細胞，觀察其生長和增殖狀態(tài)，具體方法如下： (1)細胞活性分析：首先除去培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)清洗，然后取500 μL AO的染液(20 μg/mL)，用PBS定容至2 mL，配制成終濃度為10 μg/mL的溶液，放入培養(yǎng)皿中室溫下孵育10 min；再將PI染液用PBS配制成相同的終濃度溶液，放入培養(yǎng)皿室溫下孵育10 min；用熒光顯微鏡觀察。(2)活細胞染色：首先除去培養(yǎng)基，然后取適量CellTracker工作液(10 μmol/L，37 ℃預熱)孵育40 min；棄染液，添加已預熱(37 ℃)的新鮮DMEM溶液，繼續(xù)培養(yǎng)30 min。最后制備適宜濃度的細胞懸液。

1.2.3圖像獲取與分析粒子運動熒光圖片通過熒光倒置顯微鏡(OLYMPUS,CKX41)和配套的CCD圖像采集系統(tǒng)(OLYMPUS,DP73)來拍攝。圖片以及數(shù)據分別通過Image-Pro? Plus 6.0(Media Cyternetics,Silver Spring,MD)，origin 9(origin Inc.)，和 SPSS 12.0(SPSS Inc.)軟件來處理和分析。圖中的結果和誤差線通過平均值±標準偏差來表示。

1.2.4分離效率計算公式循環(huán)腫瘤細胞回收率和富集率的計算公式如下所示：

(1)

(2)

其中，noutlet 1代表從出口1收集的血細胞數(shù)量，ninlet代表初始灌注時血細胞的數(shù)量，Routlet 1代表出口1收集的癌細胞數(shù)量與血細胞數(shù)量的比值，Rinlet代表初始灌注時癌細胞數(shù)量與血細胞的比值。

2 結果與討論

2.1 芯片設計原理

圖2 四種功能區(qū)域(過濾區(qū)域(A)、慣性聚集區(qū)域(B)、慣性分離區(qū)域(C)和空間位阻區(qū)域(D))的掃描電鏡(SEM)圖(標尺分別為400 μm(A)、90 μm(B)、250 μm(C)、50 μm(D))Fig.2 SEM images of four functional regions(filter region(A),inertial focusing region(B) inertial separation region(C) and steric hindrance region(D))(Scale bar:400 μm in Fig.2A,90 μm in Fig.2B,250 μm in Fig.2C,and 50 μm Fig.2D)

如圖1C所示，芯片包括四種功能區(qū)域：過濾區(qū)域(a)、慣性聚集區(qū)域(b)、慣性分離區(qū)域(c)和空間位阻區(qū)域(d)。過濾區(qū)域通過十字形結構的設置(圖2A)，可以有效防止聚集的細胞或外來碎片堵塞微管道，是處理高通量血液樣品的關鍵步驟。慣性聚集區(qū)域是由120個收縮/擴張管道單元組成，總長為3.6 cm。每個收縮擴張管道長度均為150 μm，其中擴張管道的寬度為180 μm，收縮管道的寬度為60 μm(圖2B)。細胞在一連串的收縮擴張管道運動中，能夠形成不同運動軌跡[11]，較大體積的癌細胞可以聚焦在中間，較小體積的血細胞會分布在兩邊(圖1D)。慣性分離區(qū)域的主通道是由兩個側通道和一個中央通道組成(圖2C)，其中兩個側通道分別與出口1和出口3相連接，用于移除小尺寸的細胞(血細胞)。中央通道與出口2相連接用于收集大尺寸的靶細胞(CTC)(圖1E)?？臻g位阻區(qū)域包含周期性的相互具有固定間隔的等腰梯形微柱陣列欄桿(圖2D),具體設置參數(shù)如表1和圖3所示。這些微柱陣列的設置則可進一步篩選不同體積大小的細胞，實現(xiàn)腫瘤細胞的二次富集(圖1F)。

圖3 微流控裝置中空間位阻區(qū)域的結構示意圖(放大圖片展示出等腰梯形微柱陣列的設計圖，更詳細的設計參數(shù)如表1所示)Fig.3 Schematic diagram of the steric hindrance region in the microfluidic device(The amplifying image shows the diagram of isosceles trapezoid-shaped pillar array,more detailed design parameters can be found in Table 1)

2.2 慣性微流分離細胞

本實驗分別將人源性乳腺癌細胞(數(shù)量為～50 cells/mL，直徑為18.8 ± 2.3 μm)，以及人源性宮頸癌細胞(數(shù)量為～50 cells/mL，直徑為14.6 ± 2.8 μm)，添加到2%血細胞比容(～2.64 ×108cells/mL)的血液中來模擬全血中的低豐度腫瘤細胞樣品(循環(huán)腫瘤細胞與血細胞比率為～1/107)。人類血細胞主要包括紅細胞和白細胞。紅細胞直徑6.0～8.5 μm，厚度為1.8～2.8 μm，呈雙凹圓盤狀，具有高度變形性；白細胞近乎球形，直徑為7.0～20 μm，也具有可變形性質。大部分血細胞的直徑大小都要小于所要灌注的癌細胞直徑[12]。

圖5 不同Rec條件下細胞運動軌跡分析結果圖Fig.5 Analytical results of cell trajectories under different Rec

圖4 在不同Rec下慣性聚焦區(qū)域(A)和慣性分離區(qū)域(B)中的細胞運動軌跡(紅色虛線被用于分析相同縱向位置的細胞分布情況，分析結果分別在圖5中展示出來(標尺為100 μm))Fig.4 Effects of Rec on cell trajectories in the inertial focusing region(A) and separation region(B)(The red dotted lines were used to analyze cell distributions at the same longitudinal positions.Analytical results are listed in Fig.5A,corresponding to Fig.4A;Fig.5B,corresponding to Fig.4B,respectively(Scale bar:100 μm))

然后將癌細胞和血細胞的混合樣品以不同管道雷諾數(shù)：Rec=ρUmDh/μ(ρ代表流體密度，μ代表流體動態(tài)粘度，Um代表管道中流體的最大速度，Dh代表管道的流體力學直徑)灌入所設計的微流控芯片，進行血液中循環(huán)腫瘤細胞的分離篩選。首先我們將同樣位置的無細胞背景圖片提前拍攝，然后再利用背景矯正功能與相同位置的血細胞運動圖片相疊加，得到高清晰度的血細胞運動軌跡。如圖4A所示，當Rec為50時，血細胞和癌細胞只能運動聚焦到管道的中心位置，而當Rec增加到72.22時，幾乎所有的血細胞都能聚焦到靠近兩側管壁的平衡位置上，并形成清晰的60～120 μm寬度(圖5A)(這個寬度是通過測量血細胞占據兩個區(qū)域距離的半峰全寬得到的)。這種現(xiàn)象的形成是因為隨著Rec的增加，較大的慣性升力促使直徑較小的血細胞更好的克服拖曳力向兩側管壁方向聚焦。最后當Rec增加到94.44時，血細胞和癌細胞形成了三條細胞條帶，彼此之間不能清晰分開。因此基于上述結果，當Rec為72.22時，血細胞在慣性聚焦區(qū)域能夠獲得聚焦到兩側管壁的最佳灌注條件。

隨后，為進一步驗證實驗的準確性，慣性分離區(qū)域中樣品的運動情況也被研究(圖4B)。另外，通過測量其對應的細胞光強度值，更清晰的細胞運動情況能被觀察到(圖5B)。當Rec為50時，血細胞會在慣性分離區(qū)域形成一個較寬的分布范圍。隨著Rec的增加，血細胞開始傾向于向兩邊側管道運動。如圖6A所示，直到Rec為72.22時，幾乎所有的血細胞都會向兩側運動，癌細胞在中間運動(紅色箭頭標注)。當Rec再進一步增加到94.44時，血細胞又會出現(xiàn)三條細胞帶的分布情況，這與慣性聚焦區(qū)域中觀察到的細胞軌跡現(xiàn)象是一致的。由于三條細胞帶中的一條細胞帶是要從中央管道出去，它會降低癌細胞在中央管道出口處(出口2)的富集率。所以基于上述實驗結果，Rec=72.22是血液中CTC分離的最佳灌注條件，這與慣性聚焦區(qū)域的實驗結果一致。

2.3 空間位組分離細胞

圖6 在管道Rec=72.22下慣性分離區(qū)域(A)和空間位組區(qū)域(B)中細胞的運動軌跡圖。(A)紅色箭頭展示出慣性分離區(qū)域中癌細胞運動軌跡圖;(B)紅色箭頭展示出分離后的癌細胞在欄桿作用下運動軌跡圖(標尺為200 μm)Fig.6 Cell trajectories in the inertial separation region(A) and steric hindrance region(B) under Rec=72.22.(A) The red arrows indicate that the cell trajectories of isolated cells in the inertial separation region;(B) The red arrows indicate that the isolated cells were railed by the micropost array(Scale bar:200 μm)

利用前面優(yōu)化出的灌注條件，空間位阻區(qū)域中的混合樣品運動軌跡也被研究(圖6B)。當人源性乳腺癌細胞或人源性宮頸癌細胞進入空間位阻區(qū)域后，有些細胞并不能在中心線上形成單一的中央細胞條帶。本研究通過設置間距為10 μm的等腰梯形微柱陣列欄桿，能夠引導沒有聚焦在中心線的癌細胞沿著微柱陣列欄桿運動(紅色箭頭標注)，最終進入出口2，實現(xiàn)CTC的二次富集。另外，在慣性分離區(qū)域中未分離出的血細胞還會被設置的微柱陣列欄桿過濾掉，實現(xiàn)血細胞的二次移除，增加癌細胞的回收率和富集率。

2.4 分離效率與細胞活性

圖7 血細胞中人源性乳腺癌細胞分離前(Ⅰ和i)和分離后出口2(Ⅱ和ii)，出口1(Ⅲ和iii)，以及出口3(Ⅳ和ⅳ)的明視場圖和暗視場圖(為方便細胞回收率的計數(shù)，人源性乳腺癌細胞在實驗前通過CellTracker Green進行活細胞染色)(標尺為150 μm)Fig.7 Comparison of bright-field(Ⅰ-Ⅳ) and fluorescence(ⅰ to ⅳ) images of the mixture of MCF-7 and blood cells before separation(Ⅰ and ⅰ),cells collected from outlet 2(Ⅱ and ⅱ),cells from outlet 1(Ⅲ and ⅲ),and cells from outlet 3(Ⅳ and ⅳ)(To facilitate the count of cell recovery,MCF-7 cells were stained with CellTracker Green)(Scale bar:150 μm)

圖8 人源性乳腺癌細胞和人源性宮頸癌細胞收集效率和富集效率統(tǒng)計結果圖Fig.8 Evaluation of microfluidic system performance using cancer cells(MCF-7 and HeLa cells)

圖9 AO/PI雙重染色法細胞活性測試圖。(A)兩種癌細胞的明視場圖(上)和暗視場圖(下)；(B)兩種癌細胞活性的定量分析圖(標尺為50 μm)Fig.9 Cell viability of separated MCF-7 and HeLa cells using AO/PI double-staining method.(A) The bright-field(top) and fluorescence(bottom) images of two cancer cells；(B) Quantitative analysis of cellular viability of control(unseparated) and separated rare cells(Scale bars:50 μm)

最后，在最優(yōu)灌注條件Rec=72.22下，我們對每個獨立樣品進行了分離效率的統(tǒng)計分析(圖7)。首先，癌細胞在灌注前通過活細胞染色進行了熒光標記，便于計算其回收率和富集率(人源性乳腺癌細胞用CellTracker Green CMFDA進行活細胞染色，人源性宮頸癌細胞用CellTracker Orange CMRA進行活細胞染色)。實驗結果表明，兩種癌細胞的回收率均大于95.20%，富集效率均大于2.05×105(圖8)。由于一些沒有良好聚焦的癌細胞在經過等腰梯形微柱陣列欄桿時，會受到高剪切應力的影響，它們的細胞活性需要被進一步檢測。利用AO/PI雙重染色法對參與分離和未參與分離(對照組)的癌細胞進行活性分析統(tǒng)計。結果表明，通過芯片結構分離后的癌細胞仍然具有較好的活性，與對照組的癌細胞活性相似，都能達到93%以上的細胞存活率(圖9)。

圖10 分選后人源性乳腺癌細胞和人源性宮頸癌細胞活性測試圖(培養(yǎng)36 h)(標尺為50 μm)Fig.10 Cellular viability assay of isolated MCF-7 and HeLa cells by reseeding them back in culture for 36 h(Scale bar：50 μm)

最后，我們通過培養(yǎng)和增殖兩種染色的癌細胞，如圖10所示。進一步證明了本實驗方法不會對CTC活性產生影響。

為此，本研究將高通量的慣性微流方法與高回收率的空間位阻方法結合，建立一種新型血液CTC分離裝置。該裝置能夠通過慣性微流分離區(qū)域移除大量的血液細胞，然后再通過等腰梯形微柱陣列欄桿來進行二次分離，最終完成高通量、高效率和高活性的CTC分離。基于這種新方法，利用實驗室所培養(yǎng)的人源性乳腺癌細胞和人源性宮頸癌細胞混入正常的人體血液，從而模擬癌癥患者血液，可以在不使用任何抗體標記的情況下從血細胞比容2%的血液中成功分離出癌細胞。分離速率均達到3.43 × 107cell/min，癌細胞回收率與富集率均分別大于95.20%和2.05×105。對比目前存在的諸多循環(huán)腫瘤細胞分離方法，該技術具有高回收率、高通量、高活性及高富集率的明顯優(yōu)勢，結果如表2所示。

表2 血液中循環(huán)腫瘤細胞不同分離方法的比較

3 結論

本研究以微流控芯片為基礎，整合不同功能的多級連續(xù)分離裝置，有潛力應用于血液中循環(huán)腫瘤細胞的“液體活檢”，為癌癥早期診斷及治療提供及時、方便、準確的檢測方法。這種方法不僅可以達到高效率分離，而且對比其他微流控方法，具有結構簡單(無需機械或電子部件)、操作方便、易于作為功能模塊與現(xiàn)有的一些實驗設備結合的優(yōu)點。這些優(yōu)點不但可以大大降低微流控裝置的制作成本，還有利于微流控技術的推廣和使用。作為一種新的研究方向，微流控芯片上慣性微流與空間位阻的結合研究具有的諸多優(yōu)勢和特點，一定會在生物分析、醫(yī)學研究以及臨床診斷等領域中具有更加廣闊的應用前景。作為一種非侵入性的新型診斷工具，它對建立新型癌癥患者病情檢測微型分析平臺具有重要意義。