王可可， 楊 柯， 趙 俊， 朱燦燦， 朱 靈*， 劉 勇

(1.中國科學院合肥物質(zhì)科學研究院應用技術(shù)研究所，安徽省生物醫(yī)學光學儀器工程技術(shù)研究中心，安徽省醫(yī)用光學診療技術(shù)與裝備工程實驗室，安徽合肥 230031;2.中國科學技術(shù)大學，安徽合肥 230026)

血液病毒感染是一個嚴峻的全球性問題，而血站在確保輸血安全這一過程中扮演著非常重要的角色。常規(guī)的血液病毒篩查方法，如酶聯(lián)免疫分析(ELISA)方法，其檢測靈敏度低且病毒檢測的“窗口期”較長[1]。為此，人們發(fā)展了核酸擴增檢測(NAT)方法，與傳統(tǒng)的免疫學篩查方式相比，NAT具有高度的靈敏性和特異性，可大幅降低病毒檢測“窗口期”，有效彌補了ELISA方法中病毒變異、免疫靜默等原因造成的漏檢[2]，現(xiàn)已被廣泛應用于血站血液核酸病毒的篩查[3]。

目前省級中心血站的NAT檢測設(shè)備，如羅氏Cobas s201系統(tǒng)、諾華(chiron)TIGRIS全自動核酸檢測分析系統(tǒng)、上海浩源ChiTaSBSS1200核酸血液篩查系統(tǒng)，他們共同特點是主要由混樣儀、核酸提取儀和熒光定量聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)儀等組成，價格昂貴，且存在檢測步驟繁瑣、檢測成本高等問題，不利于推廣應用。特別是難以滿足即時診斷(POCT)方面的需求，因此，研發(fā)一種自動化、低成本且適宜于中小型血站使用的新型核酸分析設(shè)備十分重要。

微流控芯片技術(shù)經(jīng)過多年的發(fā)展已成為一種理想低成本檢測平臺[4]，在生命科學領(lǐng)域，尤其是在核酸檢測方面得到了廣泛的應用[5]。與此同時，隨著3D打印技術(shù)的發(fā)展，使得微流控芯片上實現(xiàn)結(jié)構(gòu)的靈活設(shè)計與快速制備成為可能[6]。本研究采用3D打印和聚二甲基硅氧烷(PDMS)注塑模技術(shù)，制作了一種集成芯片氣動閥和“樹型”結(jié)構(gòu)為一體的微流控芯片，對芯片進行了熱力學仿真，并結(jié)合實驗室自主開發(fā)的微流控熒光定量PCR分析系統(tǒng)，實現(xiàn)了血液中HBV病毒的快速檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

Objet 30Pro 3D打印機(美國，Stratify公司)；PDC-32G等離子清洗機(美國，Harrick公司)；自制實時熒光定量PCR擴增分析儀，其熒光檢測系統(tǒng)檢測波長為510 nm，溫控精度為0.1 ℃[7]；KW-4A型臺式勻膠機(中國)。

聚二甲基硅氧烷(PDMS，Sluggard 184，美國DowCorning公司)；乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)(1型)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光法，上海浩源生物科技有限公司)；無水乙醇(分析純，國藥集團化學試劑公司)；硅油(美國Sigma公司)；血液樣本由安徽省血液中心提供。

HBV、HCV、HIV特異性引物和Taqman探針的設(shè)計：針對HBV、HCV、HIV基因序列的保守區(qū)域，設(shè)計擴增這3種病毒特異性引物和Taqman水解探針，用于對應基因片段的擴增，引物和探針均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其序列見表1。

表1 HBV、HCV、HIV實時熒光定量PCR/RT-PCR引物和探針

1.2 芯片設(shè)計

芯片借鑒經(jīng)典的“三明治結(jié)構(gòu)”設(shè)計[8]，分為四層。如圖1(A)中所示：上層為芯片的氣路控制層；第二層為PDMS薄膜用于微閥的封閉和開啟；第三層為芯片的液路層；底層則為玻璃基底。芯片整體功能如圖1(B)所示，分布有主通道、分支通道、反應腔和廢液腔；芯片大小32×38×4 mm，其中主通道長30 mm，高0.5 mm，負責樣品的進樣；分支通道負責分流試劑到反應腔；每個反應腔體積約為15 μL，兩端均設(shè)有微閥和排氣孔，用來控制反應腔試劑進樣和密封；廢液腔則用來儲存多余的廢液。針對血站血液篩查檢測對象及流程，在芯片上設(shè)置六個獨立的反應腔1～6分別作為HBV、HCV、HIV三種病毒的陰性和陽性對照腔，其余反應腔分為3組分別作為三種病毒檢測實驗的復孔。

圖1 (A)微流控芯片結(jié)構(gòu)示意圖；(B)微流控芯片功能示意圖Fig.1 (A)Structure schematic of microfluidic chip;(B)Features schematic of microfluidic chip

1.3 芯片制備

使用Soildworks軟件設(shè)計微流控芯片所需模具結(jié)構(gòu)，使用3D打印機打印芯片模具[9]，設(shè)置打印精度為16 μm。微流控芯片制備采用注塑法。PDMS前聚體和促凝劑以10∶1比例均勻混合后置于真空抽氣泵中除去氣泡備用。將PDMS倒入芯片模具并置于100 ℃恒溫烘箱中烘烤固化2 h，以制備微流控芯片上下基片；同時緩慢傾倒約1 mL PDMS在4英寸的硅基片中央，置于勻膠機中，設(shè)置初始轉(zhuǎn)速為500 r/min，保持時間18 s，隨后升高轉(zhuǎn)速至700 r/min，保持55 s，最后將硅片放入烘箱中烘烤10 min以制備微流控芯片薄膜。從模具上取出PDMS上下芯片和PDMS薄膜，并用氧等離子清洗機處理45 s，使芯片永久鍵合。

前期實驗發(fā)現(xiàn)反應腔體內(nèi)進行PCR反應時通常會產(chǎn)生氣泡，造成不同反應腔體之間反應液串樣或反應液從排氣孔處泄露。為提高實驗成功率，推薦在實驗開始前注入去離子水預先浸潤芯片1 h[10]。

1.4 芯片熱力學仿真

PCR過程有3個不同的溫度階段，而反應容器良好的導熱性和溫度均勻性是微流控芯片上能否成功進行PCR的關(guān)鍵。因此，本研究針對所設(shè)計芯片進行熱力學仿真，探究芯片在特定溫度下的導熱性能和溫度均勻性。將芯片的Solidworks源文件轉(zhuǎn)換為SLDPRT格式并導入到Comsol仿真軟件的幾何模型之中，對芯片加載不同材料并設(shè)置導熱的邊界條件和求解域，其中芯片材質(zhì)分別設(shè)置為PDMS(厚度3.7 mm)和玻璃(厚度0.3 mm)，并基于PCR過程的3個溫度階段設(shè)置芯片底面溫度曲線，仿真特定溫度下設(shè)計微流控芯片的導熱性和溫度均勻性，其中溫度設(shè)置如圖2(A)曲線所示，芯片材料設(shè)定如圖2(B)和圖2(C)所示。

圖2 (A)仿真時施加的溫度場曲線；(B)芯片幾何模型中的PDMS材質(zhì)部分；(C)芯片幾何模型中的Glass材質(zhì)部分Fig.2 (A)The temperature field curve applied in the simulation；(B)PDMS material components in the chip geometry model；(C)Glass material components in the chip geometry model

1.5 PCR實驗設(shè)置

將對照組反應試劑加入到1～6號獨立反應腔，并進行封閉。然后，將HBV、HCV、HIV實時熒光定量PCR/RT-PCR引物和探針分別預埋到反應腔7和8、9與10、11和12中，打開每個反應腔兩端的微閥，將從血液樣品中提取出的核酸溶液與PCR擴增試劑混勻后，從加樣孔注入到主通道內(nèi)，反應液會在芯片的親水性和壓力作用下依次填充反應腔，關(guān)閉微閥，封閉反應腔排氣孔，再注入硅油充盈主通道以隔離反應腔。進樣完成后，將芯片置于自行研制的實時熒光定量PCR擴增儀內(nèi)，于熱層上均勻涂抹導熱硅脂以增強芯片溫度均勻性。設(shè)置PCR擴增反應參數(shù)，程序為：37 ℃，2 min，1個循環(huán)；50 ℃，5 min，1個循環(huán)；42 ℃，35 min，1個循環(huán)；94 ℃，10 min，1個循環(huán)；隨即擴增45個循環(huán)(94 ℃，10 s；55 ℃，15 s；65 ℃，45 s)。整個擴增實驗中CCD相機于每個循環(huán)內(nèi)65 ℃ 結(jié)束時完成芯片熒光信號的采集，并實時分析處理數(shù)據(jù)繪制擴增曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 熱力學仿真

對PCR過程中不同溫度階段(94 ℃、55 ℃、65 ℃)的芯片進行了熱仿真分析，三個溫度階段內(nèi)芯片的溫度均勻性和導熱性能良好。圖3(A)所示是94 ℃條件下芯片整體溫度仿真結(jié)果，12個反應腔無溫度差異，性能高度一致，芯片溫度均勻性良好；圖3(B)是此條件下芯片的等溫面，等溫面的形成與芯片的高度密切相關(guān)，反應腔所在高度可保證最大的溫度傳遞性能，使得反應腔溫度與芯片基底溫度保持同步。但此時芯片反應腔最高溫度只有366.22 K比預設(shè)的溫度94 ℃(367.15 K)低了0.93 ℃左右，說明芯片內(nèi)部溫度相較于預設(shè)溫度會略有偏低，此點符合實際條件下芯片的導熱情況，說明仿真結(jié)果的可靠性。在實際溫控過程中，通常會在溫控算法的缺省溫度條件設(shè)置時通過調(diào)節(jié)PID參數(shù)，將不同溫度階段的初始溫度設(shè)置偏高，使得芯片反應腔溫度最大程度上與圖2(A)中理想的溫度曲線一致。

圖3 微流控芯片熱仿真結(jié)果Fig.3 Results of microfluidic chip thermal simulation

2.2 核酸檢測

圖4 擴增曲線Fig.4 Amplification curves

芯片上病毒核酸擴增結(jié)果如圖4所示，可以看出腔體1、3、5中HBV、HCV、HIV三種病毒陽性對照均得到有效擴增；相對應的，腔體2、4、6中陰性對照則無擴增，說明整個測試結(jié)果滿足質(zhì)控要求。對于待測樣本的檢測結(jié)果，可以觀測到HBV引物探針對應的腔體7和8中熒光信號逐漸增強；而HCV引物探針對應的腔體9和10，HIV引物探針對應的腔體11和12中熒光信號均無明顯變化，表明該血液核酸樣品中含有HBV DNA，通過實時計算，確定其Ct值在37左右，檢測結(jié)果呈HBV弱陽性。因此，可以初步表明該型芯片可以用于血液篩查中病毒核酸的檢測。

3 結(jié)論

設(shè)計的微流控芯片導熱性能和溫度均勻性良好，在芯片上成功檢測出血液樣本中的HBV。實驗結(jié)果表明，血液樣本熒光PCR擴增的Ct值約為37，呈HBV弱陽性。本研究受限于難以獲得HCV和HIV陽性樣本，因此，未能在該型芯片上完成對HCV和HIV的測試，但對這兩種病毒在微流控芯片上的檢測仍具有很大的參考性，并可進一步優(yōu)化芯片設(shè)計，實現(xiàn)多種病毒核酸的并行檢測，為后續(xù)微流控芯片上集成化血液核酸檢測系統(tǒng)研究打下了基礎(chǔ)，在血站血液病毒核酸檢測和術(shù)前血液篩查等即時診斷方面有很好的應用前景。