左應(yīng)梅，許宗亮，楊維澤，楊紹兵，楊天梅，楊美權(quán)，張金渝

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 藥用植物研究所，云南 昆明 650200)

珠子參PanaxjaponicusC.A.Meyer varmajor(Burk.)C.Y.Wu et K.M.Feng)又名扣子七，屬五加科人參屬植物，其根莖為藥材珠子參，具有活血散瘀，補血止血，消腫止痛等類似三七的功效。珠子參主要分布在陜西、四川、云南、湖北、甘肅、貴州、西藏等地，是秦巴山區(qū)特色中藥材“太白七藥”之一，現(xiàn)代藥理實驗證明其具有提高免疫功能、增強造血功能、抗腫瘤、抗心律不齊及抗炎等作用[1]。目前，珠子參的研究主要集中在資源分布、化學(xué)成分、藥理作用、臨床應(yīng)用及分子生物信息學(xué)等方面[2-7]。有關(guān)生理生態(tài)特性方面的研究較少，左應(yīng)梅等研究表明，相同栽培條件下珠子參不同居群的光合特性、保護酶活性、丙二醛含量(MDA)和葉綠素含量存在一定差異[8]；黃文靜等研究表明，三年生珠子參地上部分生長旺盛，葉綠素含量和保護酶活性較高，對光能的捕獲、有機物的同化、以及對環(huán)境的適應(yīng)能力高于二年生和苗期珠子參[9]；30%遮陰處理下珠子參株高、主莖粗、果實數(shù)、根莖直徑、葉綠素含量、SOD和POD活性增加，地下根莖節(jié)間長度和葉片MDA含量減小[10]。而珠子參對海拔高低的生理響應(yīng)和自身抗氧化適應(yīng)方面的研究鮮見報道。

本研究擬通過測定20個居群珠子參的過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量，探討各類居群的CAT、POD和SOD活性和MDA含量隨海拔梯度的變化規(guī)律，探明珠子參不同類群的抗氧化能力對海拔的響應(yīng)特性，為珠子參的野生馴化、優(yōu)良品種的選育及栽培的生態(tài)適應(yīng)性提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究材料共20個居群珠子參，其采集地點及地理位置見表1。采樣時間為2016年7月～8月。每個采樣點采取具有代表性的10個植株，所采植株大小基本一致，地下根莖個數(shù)為5～6個的代表性正常成熟植株。將葉片裝于自封袋，密封后迅速放入-80 ℃液氮保存。

1.2 方法

1.2.1 保護酶活性測定

酶液提取參照高俊鳳的方法[11]，略有改進，即稱取新鮮珠子參葉片約0.5 g于預(yù)冷的研缽中，加適量預(yù)冷的0.05 mol·L-1(pH 7.8)磷酸緩沖液、少量石英砂和聚乙烯吡咯烷酮于冰浴上研磨成漿，轉(zhuǎn)移到刻度離心管，用磷酸緩沖液沖洗研缽2～3次，使終體積為8 mL。將提取液在4 ℃下12 000 r·min-1離心15 min，上清液用于CAT、POD、SOD活性測定及MDA含量測定。

SOD總活性采用NBT(淡藍四唑)光還原法測定，以抑制NBT光還原反應(yīng)50%所需的酶量為一個酶活性單位(U)，活性以U·g-1FW表示；POD活性采用愈刨木酚顯色法測定，以每分鐘OD470變化0.01為一個過氧化物酶活性單位(U)，活性以U·g-1FW·min-1；CAT活性采用紫外吸收法測定以1 min內(nèi)OD240降低0.01為一個酶活性單位(U)，活性以U·g-1FW·min-1表示[11]。

1.2.2 丙二醛含量性測定

MDA含量測定參照Zhang和Kirkham[12]的方法。取上述酶提取液1.5 mL，加入2.5 mL0.5%的硫代巴比妥酸(用5%三氯乙酸配制)，沸水中加熱20 min，冰浴速冷，離心，取上清液于分光光度計上分別測定450、532和600 nm處的吸光值，計算MDA含量，含量以nmol·g-1FW表示。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Microsoft Excel 2007軟件對數(shù)據(jù)進行處理和繪圖，采用JMP7統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行差異顯著性檢驗(Tukey法)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同居群保護酶活性和丙二醛含量比較

由表2可知，CAT活性最大的是居群1，最小的是居群8。居群1的CAT活性顯著大于居群2、5、6、8、9、10、11、12、14、15、16、17；居群3、4、7、13、18、19和20(前)之間的CAT活性差異不顯著，居群5、6、8、9、10、11、14、15、16和17(后)之間的CAT活性差異不顯著，但前面一組的CAT活性顯著大于后面一組。POD活性最大的是居群1，最小的是居群6。居群1的POD活性除了與居群8、12間的差異不顯著，與其余居群間的差異均達顯著水平；居群2、3、13、14、15、16、17、19(前)間的POD活性差異不顯著，居群4、5、6、7、9、10、11、18、20(后)間的POD活性差異不顯著，其中前一組居群的POD活性顯著大于后一組的居群6、7和9。SOD活性最大的是居群13，最小的是居群17。居群13的SOD活性顯著大于居群9和17，與其余居群間的差異均不顯著。MDA的含量最大的是居群15，最小的是居群4。居群15的MDA含量顯著大于居群4和7，與其余居群間的差異均不顯著。由此可見，20個居群珠子參的保護酶活性和丙二醛含量存在一定差異，可能與其生長的海拔高度等因素有關(guān)。

注：采用JMP7統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行差異顯著性檢驗(Tukey法)，同行數(shù)據(jù)后不同字母表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05。

2.2 聚類分析

從以上分析可知，20個居群珠子參的保護酶活性和丙二醛含量存在一定差異。我們根據(jù)CAT、POD、SOD活性和MDA含量對20個珠子參居群進行聚類分析(Ward法)，當(dāng)距離為1.64時分為3類(圖1)。第Ⅰ類包括1、3、9、18、4和7，共計6個居群；第Ⅱ類包括2、5、10、19、20和14，共計6個居群；第Ⅲ類包括6、12、13、11、16、17、8和15，共計8個居群。

2.3 各類居群的保護酶活性和丙二醛含量

為了比較各類居群的保護酶活性和丙二醛含量的差異，對CAT、POD、SOD活性和MDA含量的均值分別進行差異顯著性檢驗。由表3可知，POD和SOD活性在各類居群間的差異不顯著；第Ⅰ類居群的CAT活性分別是第Ⅱ、Ⅲ類居群的1.45倍和1.74倍，其中第Ⅰ類的顯著大于第Ⅲ類的；第Ⅲ類居群的MDA含量分別是第Ⅰ、Ⅱ類的2.28倍和1.52倍，三者間的差異達顯著水平。

圖1 20個居群珠子參的聚類分析樹狀圖

注：采用JMP7統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行差異顯著性檢驗(Tukey法)，同行數(shù)據(jù)后不同字母表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P< 0.05。

2.4 各類居群的保護酶活性和丙二醛含量與海拔高度間的關(guān)系

為了探討各類居群的保護酶活性和丙二醛含量與海拔高度間的關(guān)系，將各類居群的CAT、POD、SOD活性和MDA含量分別與海拔高度進行分析，結(jié)果如圖2、3、4。由圖2-A，B，C 可以看出在海拔2600～3600 m范圍內(nèi)，第Ⅰ類居群的CAT、POD和SOD活性，隨著海拔的升高呈二次凹函數(shù)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r分別為0.639 6、0.597 1和0.634 4；MDA含量與海拔高度間相關(guān)性較差(圖2-D)。由圖3-A，B，C，D可以看出，在海拔2600～3600 m范圍內(nèi)，第Ⅱ類居群的CAT、POD、SOD活性和MDA含量與海拔高度無相關(guān)性。由圖4-A，C可以看出，在海拔2600～3600 m范圍內(nèi)，CAT和SOD活性與海拔呈正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r分別為0.377 9和0.526 2；POD活性與海拔呈負相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r為0.506 9；(圖4-B)；MDA含量與海拔高度間無相關(guān)性(圖4-D)。

3 討論與結(jié)論

圖2 第Ⅰ類居群的CAT、POD、SOD活性和MDA含量隨海拔高度的變化情況

圖3 第Ⅱ類居群的CAT、POD、SOD活性和MDA含量隨海拔的變化

圖4 第Ⅲ類居群的CAT、POD、SOD活性和MDA含量隨海拔的變化

各種逆境對植物體的傷害大多與植物體內(nèi)自由基代謝平衡有關(guān)。逆境能引起植物體內(nèi)活性氧代謝紊亂，從而引起自由基的積累和膜脂過氧化，使膜系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能受到損傷，造成植物細胞傷害，其中表現(xiàn)之一就是細胞中MDA含量的增加[13]。相應(yīng)地植物體內(nèi)也形成復(fù)雜的抗氧化系統(tǒng)，保護植物免受活性氧傷害[14-16]。SOD被認(rèn)為是植物體內(nèi)氧代謝的關(guān)鍵酶，它的活力變化直接影響植物體內(nèi)O2-與H2O2的含量；POD是活性較高的適應(yīng)性酶，是細胞中降解活性氧(ROS)的保護酶復(fù)合物的一員，其主要作用是清除H2O2以保護細胞；CAT主要存在于植物的過氧化物體(或乙醛酸循環(huán)體)中，主要功能是清除光呼吸或脂肪酸β-氧化過程中形成的H2O2。活性氧的清除涉及一系列細胞代謝和酶促反應(yīng)過程，由非酶保護系統(tǒng)和酶保護系統(tǒng)的成員協(xié)同作用使細胞內(nèi)的活性氧維持在較低水平，確保植物正常生長和代謝[17]。SOD、POD和CAT是保護酶系統(tǒng)的主要酶，SOD、POD和CAT協(xié)同作用可降低其對膜脂的攻擊，其活性的高低可反映植物對環(huán)境條件適應(yīng)能力的強弱[18-21]。

在經(jīng)緯度和海拔等自然梯度上，氣候、植被和土壤等環(huán)境因子具有明顯的和系統(tǒng)性的變化規(guī)律。其中，海拔梯度是一復(fù)合梯度，海拔高低不同，有可能造成不同地區(qū)光、溫、水、氣、肥的巨大差別，從而影響植物生長[22]。Wildi和Lütz認(rèn)為，植物體內(nèi)保護物質(zhì)對海拔的變化有著各自不同的響應(yīng)模式[23]。

本研究從珠子參的保護酶活性和膜質(zhì)過氧化水平對20個居群珠子參進行聚類分析，然后分析各類居群對海拔梯度的響應(yīng)特性。結(jié)果表明，20個居群珠子參可分為3個類群，隨著海拔高度的升高，各類居群的保護酶活性和丙二醛含量表現(xiàn)出不同的響應(yīng)特性。第Ⅰ類居群的保護酶CAT、POD和SOD活性隨著海拔的升高呈現(xiàn)“高-低-高”的變化趨勢。這表明當(dāng)海拔相對較低時，珠子參植株體內(nèi)CAT、POD和SOD活性增強，能有效地清除體內(nèi)由生態(tài)因子脅迫而產(chǎn)生的活性氧，保護細胞免受傷害。隨著海拔升高，生態(tài)條件適合珠子參生長而改變代謝途徑使產(chǎn)生的活性氧自由基降低，CAT、POD和SOD活性也隨之降低，說明該類居群珠子參植株具有性喜冷涼的生物學(xué)特性。當(dāng)海拔較高時，CAT、POD和SOD活性又呈增強的趨勢，這可能是由于在高海拔條件下溫度下降，較低的土壤溫度影響了珠子參植物根系對土壤水分的吸收能力，受到了較嚴(yán)重的水分脅迫等不利因素的影響，抗逆酶活性誘導(dǎo)增強，這與陳曉莉等在祁連圓柏上的研究結(jié)果類似[24]。在海拔2600～3600 m范圍內(nèi)，隨著海拔的升高，CAT、POD、SOD活性表現(xiàn)出相同的變化趨勢，這表明三種抗氧化酶具有較強的協(xié)同作用關(guān)系，能及時有效地清除由于海拔改變而產(chǎn)生的活性氧自由基，使得MDA含量保持在較低水平，三個抗氧化保護酶的協(xié)同作用與該類居群的抗逆性和對環(huán)境的適應(yīng)性密切相關(guān)，可能是珠子參居群適應(yīng)環(huán)境脅迫的重要生理機制之一。第Ⅱ類居群，隨著海拔的升高，CAT、POD、SOD活性和MDA含量隨海拔高度變化的規(guī)律不明顯，這表明在海拔2600～3600 m范圍內(nèi)，由于生態(tài)因子變化并未使得該類居群的保護酶活性等方面發(fā)生明顯變化，海拔可能不是最主要的影響因子。第Ⅲ類居群，在海拔2600～3600 m范圍內(nèi)，CAT和SOD活性與海拔高度呈正相關(guān)關(guān)系，POD活性與海拔高度呈負相關(guān)關(guān)系；MDA含量隨海拔高度變化的規(guī)律不明顯，但其含量顯著大于第Ⅰ和Ⅱ類居群。這表明，隨著海拔的升高該類居群的CAT、SOD的活性有一定的增加，但CAT活性顯著小于第Ⅰ類居群，POD活性下降，三種抗氧化酶系統(tǒng)的協(xié)同作用小，對清除活性氧自由基的作用減弱，因此膜質(zhì)過氧化程度較高，生態(tài)適應(yīng)性差。

綜合本次研究表明，隨著海拔的升高，3類居群珠子參植株對由海拔引起的生態(tài)因子變化的適應(yīng)能力不同，第Ⅰ類居群的膜質(zhì)過氧化程度最低，生態(tài)適應(yīng)性較好；第Ⅲ類的膜質(zhì)過氧化程度最高，生態(tài)適應(yīng)性較差。保護酶CAT、POD和SOD活性隨著海拔的升高也表現(xiàn)出不同的響應(yīng)特性，因此，從抗氧化系統(tǒng)和膜質(zhì)過氧化水平角度對珠子參居群進行分類，并研究各類居群對海拔變化的響應(yīng)特性，探討其生態(tài)適應(yīng)性機制，可為珠子參的引種馴化和栽培的生態(tài)適應(yīng)性提供理論參考。此外，20個居群珠子參的生理特征并沒有完全依地理距離而聚類，即珠子參居群間生理特征的變異存在不連續(xù)性，這可能是生活在不同生境中的珠子參在形態(tài)等方面發(fā)生了適應(yīng)性變化，在生理特征方面也同樣發(fā)生了變異，這與麻櫟不同種源表型性狀聚類分析的結(jié)果與其種源地理分布的相關(guān)性不明顯[25]與云南含笑6個天然居群的表型性狀并沒有嚴(yán)格依地理距離而聚類[26]的研究結(jié)果類似。