楊長花，彭修娟，衛(wèi)昊，盧憲珍

(1.陜西國際商貿(mào)學(xué)院，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046；3.陜西核工業(yè)二一五醫(yī)院，陜西 咸陽 712000)

鐵棒錘AconitumpendulumBusch來源于毛茛科烏頭屬植物，藥用部位為塊根及幼苗[1]。鐵棒錘塊根能祛風(fēng)止痛，散瘀止血，消腫拔毒，用于風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛，腰腿痛，跌打損傷；外用治淋巴結(jié)結(jié)核(未破)，癰瘡腫毒[2]；幼苗具有解毒，消腫止痛的功效，用于跌打損傷，刀傷，癰腫，瘡癤[1]。主產(chǎn)陜西南部、西藏、云南西北部、四川西部、青海、甘肅南部及河南西部[3]。鐵棒錘含有烏頭堿、中烏頭堿、次烏頭堿、3-乙酰烏頭堿、去氧烏頭堿等二萜類生物堿[4-7]，二萜類生物堿既是有效成分，也是毒性成分，3-乙酰烏頭堿及去氧烏頭堿有顯著的鎮(zhèn)痛抗炎活性[8-9]，筆者已經(jīng)測定了烏頭堿、中烏頭堿、次烏頭堿的含量，現(xiàn)對(duì)3-乙酰烏頭堿、去氧烏頭堿的含量進(jìn)行測定。據(jù)《陜西中草藥》記載，鐵棒錘以其塊根入藥味苦辛，性熱，有大毒，具活血祛瘀，祛風(fēng)濕，止痛的功效，用于跌打損傷，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，腰腿痛，勞傷，惡瘡，癰腫，無名腫毒，凍瘡，毒蛇咬傷等。民間一直以采挖野生資源入藥，隨著資源采挖量的日益增加和環(huán)境惡化，野生資源日趨枯碣，藥用部位的綜合利用是解決這一問題的有效途徑。國內(nèi)對(duì)鐵棒錘研究主要集中在塊根的化學(xué)成分上，而對(duì)地上部分(莖、葉、花、果實(shí))的生物堿研究較少[6]。本研究采用HPLC法測定鐵棒錘不同生長期不同藥用部位中3-乙酰烏頭堿、去氧烏頭堿的含量，旨在認(rèn)識(shí)生物堿在植物內(nèi)積累的動(dòng)態(tài)變化過程，為人工采收、合理使用、資源開發(fā)、質(zhì)量控制、安全用藥等提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

高效液相色譜儀(品牌：Waters，型號(hào)：E2695，2489紫外檢測器)；TE124S分析天平(萬分之一，Sartorius公司)；CP225D電子分析天平(十萬分之一，Sartorius公司)；PHS-3CPH酸度計(jì)(上海佑科)；FW-100D高速萬能粉碎機(jī)(天津鑫博得儀器有限責(zé)任公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試藥

3-乙酰烏頭堿對(duì)照品、去氧烏頭堿對(duì)照品(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)P09J7F17616、R29S7F22212，HPLC≥98%)，乙腈、碳酸氫銨、鹽酸、甲醇、乙醚、三氯甲烷、硫酸、濃氨水，其中乙腈為色譜純，其余為分析純。

鐵棒錘于2015年6月到9月采自秦嶺太白山上板寺地區(qū)，洗凈，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)雷國蓮教授鑒定為鐵棒錘AconitumpendulumBusch，分離根、莖、葉、花、果實(shí)等藥用部位，干燥，粉碎備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：DiamonsilC18柱(250 mm×4.6 mm，20 μm)；流動(dòng)相：A(乙腈)，B(0.03 mol·L-1碳酸氫銨溶液，濃氨水調(diào)PH值到9.5)，洗脫程序見表1梯度洗脫；流速1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃；檢測波長：230 nm[10]。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取3-乙酰烏頭堿及去氧烏頭堿對(duì)照品適量，用0.01%鹽酸-甲醇溶液配置成濃度分別為664、735 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取鐵棒錘粉末約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入乙醚60 mL和氨試液4 mL，密塞，搖勻，靜置過夜，過濾，藥渣加入乙醚40 mL連續(xù)超聲1 h，過濾，然后用乙醚洗滌藥渣3次，每次10 mL，過濾，合并濾液與洗液，低溫蒸干，棄去藥渣。殘?jiān)尤燃淄? mL使溶解，轉(zhuǎn)入分液漏斗中用三氯甲烷3 mL分次洗滌容器，洗液并入分液漏斗中再用0.05 mol·L-1硫酸提取三次，每次5 mL，用10 mL三氯甲烷洗滌酸液，加氨試液將酸液pH值調(diào)至9，然后用三氯甲烷提取3次，每次10 mL，最后用20 mL水振搖洗滌三氯甲烷液，低溫蒸干三氯甲烷液。殘?jiān)眠m量0.01%鹽酸-甲醇溶解轉(zhuǎn)入5 mL容量瓶中，用0.01%鹽酸-甲醇定容至刻度線，搖勻[10-12]。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10.0 μL，進(jìn)樣，測定峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程為3-乙酰烏頭堿Y=0.6×106X-1.3×104，r=0.999 8；去氧烏頭堿Y=1.2×106X+3.78×105，r=0.997 4，表明3-乙酰烏頭堿在0.664～6.64 μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，去氧烏頭堿在0.735～7.35 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣4 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積，3-乙酰烏頭堿、去氧烏頭堿峰面積的RSD分別為1.7%、1.14%(n=5)，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取樣鐵棒錘塊根藥粉1份，按2.3供試品溶液制備方法進(jìn)行處理，分別在2、4、6、8、10 h進(jìn)樣20 μL，測定峰面積，3-乙酰烏頭堿，去氧烏頭堿峰面積的RSD值分別為2.77%，0.54%，表明3-乙酰烏頭堿、去氧烏頭堿樣品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取鐵棒錘塊根藥粉5份，按照2.3供試品溶液制備方法進(jìn)行處理，分別進(jìn)樣20 μL，測定峰面積，3-乙酰烏頭堿，去氧烏頭堿含量的RSD分別為4.77%、2.37%，表明重現(xiàn)性良好。

2.8 回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的鐵棒錘塊根藥粉5份，分別精密加入混合對(duì)照品溶液，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣20 μL，測定峰面積，計(jì)算回收率，3-乙酰烏頭堿平均回收率為90.04%，RSD為10.49%；去氧烏頭堿平均回收率為92.99%，RSD為7.37%。

2.9 樣品測定

取不同生長期不同藥用部位的鐵棒錘粉末，按照2.3項(xiàng)下制備供試品溶液，進(jìn)樣20 μL，測定峰面積，代入線性方程，計(jì)算樣品含量。不同生長期不同藥用部位鐵棒錘中3-乙酰烏頭堿、去氧烏頭堿的含量見表2，色譜圖見圖1，點(diǎn)線圖見圖2和圖3。

鐵棒錘整個(gè)生長周期中，2種活性成分在各部位累變化的趨勢(shì)基本一致，根、莖、葉在苗期(6月)和盛花期(8月)3-乙酰烏頭堿出現(xiàn)2個(gè)峰值，在苗期(6月)和7月(花前期)去氧烏頭堿出現(xiàn)2個(gè)峰值，苗期、花前期、花期，活性成分含量高，具有資源開發(fā)利用價(jià)值。果實(shí)中3-乙酰烏頭堿及去氧烏頭堿含量均較高，具有資源開發(fā)利用潛力。

表2 鐵棒錘不同生長期不同器官中3-乙酰烏頭堿及去氧烏頭堿的含量

注：A.混合對(duì)照品色譜圖；B.鐵棒錘苗期幼苗色譜圖；C.鐵棒錘花前期塊根色譜圖；D.鐵棒錘花前期葉色譜圖；E.鐵棒錘花前期莖色譜圖；F.鐵棒錘盛花期塊根色譜圖；G鐵棒錘盛花期葉色譜圖；H.鐵棒錘盛花期莖色譜圖；I.鐵棒錘果期塊根色譜圖；J.鐵棒錘果期葉色譜圖；K.鐵棒錘果期莖色譜圖；L鐵棒錘果期果實(shí)色譜圖；1.去氧烏頭堿；2.3-乙酰烏頭堿。圖1 鐵棒錘不同生長期不同器官色譜圖

圖2 6～9月鐵棒錘各部位中3-乙酰烏頭堿的累積變化

圖3 6～9月鐵棒錘各部位中去氧烏頭堿的累積變化

3 討論

鐵棒錘幼苗3-乙酰烏頭堿的含量是0.015 1%，去氧烏頭堿的含量是0.166 7%，含量均高于不同生長期根中的含量，幼苗中3-乙酰烏頭堿及去氧烏頭堿含量均較高，鐵棒錘幼苗是藏醫(yī)使用的藥用部位之一，說明是合理的?；ㄇ捌?、花期3-乙酰烏頭堿及去氧烏頭堿含量較高，綜合比較，鐵棒錘采收的最佳時(shí)節(jié)應(yīng)該是花期。3-乙酰烏頭堿的含量，花前期含量葉>莖>根，盛花期含量葉>莖>根，果期含量葉>果實(shí)>根>莖，葉、莖及果實(shí)中3-乙酰烏頭堿的含量高于不同生長期根中的含量，具有資源的開發(fā)利用潛力。在整個(gè)生長期鐵棒錘葉是3-乙酰烏頭堿含量最高的器官，在盛花期達(dá)到最大值，3-乙酰烏頭堿是次生代謝產(chǎn)物，盛花期植物綠色部分光合作用強(qiáng)，初生和次生代謝旺盛，可能產(chǎn)生并積累了較多的3-乙酰烏頭堿，使葉和莖中3-乙酰烏頭堿的含量較高。盛花期后進(jìn)入果期，生長緩慢，同時(shí)繁殖器官的營養(yǎng)消耗增大，可能活性成分也進(jìn)行了轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致了葉、莖中3-乙酰烏頭堿含量的降低和果期果實(shí)及根中3-乙酰烏頭堿含量的增加。果期葉中3-乙酰烏頭堿的含量仍高于其他器官，說明鐵棒錘葉資源具有巨大的開發(fā)利用潛力。鐵棒錘根、莖、葉中3-乙酰烏頭堿的積累趨勢(shì)不同，更加證實(shí)了這個(gè)結(jié)論鐵棒錘莖、葉中的3-乙酰烏頭堿大量轉(zhuǎn)移到根及果實(shí)中，使根及果實(shí)中3-乙酰烏頭堿含量增加，葉及莖中3-乙酰烏頭堿含量的大幅度下降。去氧烏頭堿的含量，花前期含量葉>根>莖，盛花期含量葉>根>莖，果期含量果實(shí)>根>葉>莖，葉中去氧烏頭堿的含量高，具有資源的開發(fā)利用潛力。葉中去氧烏頭堿的含量花前期和盛花期高于根，在花前期達(dá)到最大值。去氧烏頭堿是次生代謝產(chǎn)物，花前期葉片光合能力強(qiáng)，初生和次生代謝旺盛，可能產(chǎn)生并積累了較多的去氧烏頭堿，使葉中去氧烏頭堿的含量達(dá)到最大值。進(jìn)入盛花期，生長緩慢，可能活性成分也進(jìn)行了轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致了莖、葉中去氧烏頭堿含量的降低；鐵棒錘根、莖、葉中去氧烏頭堿的積累的變化趨勢(shì)相同，植物在盛花期和果期的繁殖器官進(jìn)行了組織結(jié)構(gòu)的快速生長和營養(yǎng)物質(zhì)的大量積累，可能其積累的量遠(yuǎn)大于積累的去氧烏頭堿的量，導(dǎo)致根中去氧烏頭堿的含量不是升高而是降低，計(jì)算根整個(gè)器官中去氧烏頭堿的總量發(fā)現(xiàn)去氧烏頭堿的總量是增加的，更說明去氧烏頭堿是轉(zhuǎn)移到了根中。近年來，鐵棒錘資源需求量與日俱增，供不應(yīng)求，鐵棒錘葉、莖、果實(shí)作為一種富含3-乙酰烏頭堿及去氧烏頭堿的器官，具有資源開發(fā)利用潛力，本研究探討了3-乙酰烏頭堿及去氧烏頭堿在植物體內(nèi)積累的動(dòng)態(tài)變化過程，為應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。