李婷，于海濤，金玉翠，劉曉美，李圓圓，王常瞵，吳明澤，代龍，高鵬

(山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355)

氧化是所有生物體中必不可少的反應(yīng)，氧化代謝過程中自由基的形成也是不可避免的。幾種慢性疾病如糖尿病、心血管疾病、神經(jīng)變性疾病和癌癥的發(fā)生或進(jìn)展可能與自由基的過量生成有關(guān)[1-2]。目前，許多蛋白質(zhì)水解物及其分離的肽，如大豆蛋白[3]、牛蛙皮[4]、魚皮明膠[5]、雞蛋蛋白[6]、水稻胚乳蛋白和油菜籽蛋白[7]等均已被發(fā)現(xiàn)具有抗氧化活性?？寡趸目梢杂行宄龣C(jī)體過剩的自由基，保護(hù)細(xì)胞和線粒體的正常結(jié)構(gòu)和功能，在預(yù)防和治療自由基誘發(fā)的一些慢性疾病和抗衰老方面有廣泛的應(yīng)用前景[8]。

豬皮中膠原蛋白含量達(dá)到29%[9]。通過酶解豬皮膠原蛋白得到的酶解產(chǎn)物中具有多種生理活性的肽，其中抗氧化活性多肽由于安全、高效等特點，被用于食品及化妝品中[10]。因此進(jìn)行豬皮膠原肽抗氧化性的研究具有重要的現(xiàn)實意義。目前，從豬皮中提取豬皮膠原的方法已十分成熟，常用提取方法包括堿提取、酸提取、酶解提取、熱水提取[11]。本研究直接以本實驗室前期優(yōu)化的酶解條件[12]進(jìn)行提取，對其進(jìn)行超濾分離純化，得到不同分子量肽段的膠原肽酶解液，濃縮冷凍干燥得到凍干粉，上述各組分與熱水提取得到的膠原蛋白進(jìn)行抗氧化能力比較，為從豬皮中提取抗氧化肽提供參考依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

新鮮豬皮(購于濟(jì)南家家悅超市)，胃蛋白酶(批號：090505，酶活力：3000 U·mg-1，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司)；胰蛋白酶(批號：091105，酶活力：1500 U·mg-1，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司)；牛血清白蛋白(批號：140626-200608，中國食品藥品檢定研究院)。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，批號：G1612053)、抗血酸(Vc，批號：A103537)均購自阿拉丁試劑(上海)有限公司；焦性沒食子酸、氫氧化鈉、無水碳酸鈉、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、鎢酸鈉、鉬酸鈉、硫酸鋰、鹽酸均為分析純。

1.2 儀器

卷式超濾膜(1 kDa、3 kDa，北京市旭邦膜設(shè)備有限責(zé)任公司)；FA2204B萬分之一電子天平(上海佑科儀器儀表有限公司)；BT300-2J蠕動泵(保定蘭格恒流泵有限公司)；真空冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司)；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國宇儀器制造有限公司)；UV-1800紫外可見分光光度計[島津儀器(蘇州)有限公司]；電滲析器(滄州市眾邦水處理技術(shù)有限公司)；高速離心機(jī)(上海精密儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 不同分子量豬皮膠原肽的制備

取鮮豬皮，刮去脂肪層及血、肉等雜質(zhì)，以剪刀剪成直徑小于2 mm、長度小于2 cm的碎塊，先用8倍量2%碳酸鈉溶液脫脂4 h，濾去堿液，水洗至中性，加8倍量水加熱煮沸15 min，勻漿3 min，待冷至約40 ℃，以25%鹽酸調(diào)pH至1.5～2.0，加入1.5%胃蛋白酶(3000 U·g-1)，40 ℃保溫酶解2 h，以25%氫氧化鈉溶液調(diào)pH至7.5～8.0，加入2%胰蛋白酶(1000～1500 U·g-1)，40 ℃保溫酶解4 h，酶解液加熱煮沸15 min，冰箱冷藏過夜，離心，取上清液，控制操作電壓為 30 V，上樣流速為50 L·h-1進(jìn)行電滲析脫鹽處理。取部分脫鹽后的酶解液減壓濃縮(60～65 ℃，-0.07～-0.08 MPa)至相對密度為1.10～1.15(60 ℃)，冷凍干燥后即得豬皮酶解原液凍干粉；將剩余脫鹽后酶解液先后用不同分子截留量(3、1 kDa)的超濾膜進(jìn)行分離，分別得到M>3 kDa組分、1 kDa3 kDa、1 kDa

另取鮮豬皮，切成碎塊，脫脂后，加10倍量水煎煮提取2 h，過濾，取上清液，按上述條件冷凍干燥，得到豬皮水提液凍干粉。

2.2 各組分肽含量的測定

2.2.1 溶液的配制 堿性銅的制備：取氫氧化鈉1 g，碳酸鈉5 g，加水40 mL使溶解，作為甲液；取酒石酸鉀0.5 g，加水50 mL使溶解，另取硫酸銅0.25 g，加水30 mL使溶解，將兩液混合作為乙液。臨用前，取甲液40 mL、乙液8 mL，并加水至50 mL。

對照品溶液的制備：取牛血清白蛋白對照品適量，精密稱定，加水制成每 1 mL含0.2 mg的溶液，即得。

供試品溶液的制備：分別精密量取2.1項下各組分凍干粉50 mg，置 100 mL量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取牛血清白蛋白對照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置10 mL試管中，各加水至1.0 mL，分別加入堿性銅試液1.0 mL，搖勻，再分別加入福林酚試液(取儲備液稀釋16倍)4.0 mL，立即混勻，置55 ℃水浴中反應(yīng)5 min，取出，置冷水浴中冷卻10 min，照紫外-可見分光光度法，以0號管為空白，在650 nm波長處測定吸光度。以牛血清白蛋白含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算線性回歸方程為Y=2.490 1X+0.038 5，r=0.999 5。

2.2.3 供試品測定 精密量取供試品溶液1.0 mL，照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項下自“加入堿性銅試液1.0 mL”起操作，依法測定吸光度，從回歸方程中計算各組分總肽的含量。豬皮各組分肽含量測定結(jié)果見表1。

2.3 不同分子量豬皮膠原肽體外抗氧化能力的測定

蛋白水解產(chǎn)物的分子量大小對其生理活性具有重要的意義，將2.1項下制備的樣品分別配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、0.8%、0.6%、0.4%、0.2%、0.1%的溶液，采用不同氧化機(jī)制測定不同分子量豬皮膠原肽的抗氧化能力，包括清除DPPH·活性、清除·OH活性、清除O2-·活性，分析抗氧化活性與分子量大小的關(guān)系。

2.3.1 不同分子量豬皮膠原肽組分對DPPH自由基清除能力測定 精確稱量4.10 mg DPPH，溶解到100 mL無水乙醇中，配制成濃度為6.5×10-5mol·L-1DPPH乙醇溶液。分別吸取2 mL樣液與2 mL DPPH的無水乙醇溶液置于試管中，搖勻，在室溫反應(yīng)30 min后在波長517 nm處測定吸光度(Ai)；分別吸取2 mL樣液和無水乙醇于試管中，搖勻，室溫反應(yīng)30 min后在517 nm波長處測定吸光度(Aj)；最后分別吸取2 mL DPPH無水乙醇溶液與無水乙醇于試管中，搖勻，在室溫反應(yīng)30 min后在517 nm波長處測定吸光度(Ac)[13]。按公式(1)計算DPPH自由基清除率，結(jié)果如圖1、2所示。

(1)

圖1 豬皮膠原肽各組分DPPH·自由基清除作用比較

圖2 豬皮膠原肽各組分清除DPPH·自由基能力的比較

從圖1不同分子量豬皮膠原肽對DPPH·自由基的清除率趨勢可以看出，在實驗范圍內(nèi)(0.3～6 mg·mL-1)，不同分子量豬皮膠原肽對DPPH·自由基都有一定的清除作用，且隨豬皮膠原肽質(zhì)量濃度的增加，各組分對DPPH·自由基的清除率不斷增加，表明不同分子量豬皮膠原肽對DPPH·自由基的清除率具有量效關(guān)系；隨分子量增加豬皮膠原肽清除DPPH·自由基效果呈下降趨勢，通過比較IC50，各組分清除DPPH·自由基能力順序為：小于1 kDa組分>1 kDa～3 kDa組分>酶解原液組分>水提液組分>大于3 kDa組分，小于1 kDa組分對DPPH·自由基清除率最高，其IC50值為0.836 mg·mL-1，當(dāng)質(zhì)量濃度增加到一定量時，清除DPPH·自由基能力接近Vc。起作用的主要是一些小分子量的肽，可能是由于許多功能性小肽多集中在這部分，這與一些文獻(xiàn)報道一致[14]，說明超濾處理能夠富集豬皮膠原肽中對DPPH·自由基清除活性強(qiáng)的組分。

2.3.2 不同分子量豬皮膠原肽組分對O2-·活性清除能力測定

2.3.2.1 鄰苯三酚自氧化速率的測定 取4.5 mL 50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖溶液(pH=8.2)、加4.2 mL蒸餾水于10 mL試管中，混勻后在37 ℃水浴中保溫20 min，取出后立即加入0.3 mL在37 ℃預(yù)熱過的4.5 mmol·L-1的鄰苯三酚，空白管用10 mmol·L-1鹽酸代替鄰苯三酚的鹽酸溶液，迅速混勻后倒入比色皿中，322 nm下每隔30 s測定吸光度，連續(xù)記錄4 min內(nèi)吸光度的增加，以10 mmol·L-1HCl溶液配制空白管作為對照，記錄結(jié)果[15]。

2.3.2.2 不同分子量豬皮膠原肽抑制鄰苯三酚自氧化速率的測定 按上述步驟加入pH=8.2緩沖液4.7 mL，然后分別加入肽質(zhì)量濃度為15 mg·mL-1的豬皮膠原肽溶液0.1、0.2、0.4、0.8、1.2 mL，蒸餾水補(bǔ)至4.2 mL，加入0.3 mL鄰苯三酚迅速搖勻，同樣以10 mmol·L-1鹽酸溶液作為空白管，同上測定。按公式(2)計算加入豬皮膠原肽后鄰苯三酚的自氧化速率，按公式(3)計算清除率。

(2)

(3)

式中：A3為30 s時的吸光度；A4為4 min時的吸光度；△A0為鄰苯三酚自氧化速率，△A為加入豬皮膠原肽溶液后鄰苯三酚的自氧化速率。

不同分子量豬皮膠原肽對O2-·的清除作用見圖3、4。在實驗范圍內(nèi)(0.1～1.2 mg·mL-1)，不同分子量豬皮膠原肽對O2-·均有一定清除作用，與未酶解的水提膠原肽相比，豬皮膠原蛋白酶解物具有較高的清除O2-·的能力，隨著豬皮膠原肽質(zhì)量濃度的增加，對O2-·的清除率不斷增加，通過比較IC50值，各組分清除能力順序為：小于1 kDa組分>酶解原液組分>1 kDa～3 kDa組分>大于3 kDa組分>水提液組分，結(jié)果顯示小于1 kDa組分對O2-·的清除力最強(qiáng)，其IC50值為0.42 mg·mL-1。

圖3 豬皮膠原肽各組分對O2-·清除作用比較

圖4 豬皮膠原肽各組分清除O2-·自由基能力比較

2.3.3 不同分子量豬皮膠原肽組分對·OH的清除能力測定 精密量取150 mmol·L-1pH=7.4磷酸鹽緩沖液2.0 mL、7.5 mmo1·L-1鄰二氮菲0.2 mL、7.5 mmol·L-1硫酸亞鐵溶液0.2 mL、不同豬皮膠原肽組分試樣0.4 mL、蒸餾水0.8 mL、體積分?jǐn)?shù)0.1%過氧化氫0.4 mL于試管中，混勻做試樣組，將各試管同時于37 ℃恒溫放置1 h，在536 nm處測定吸光度?？瞻捉M以蒸餾水代替樣品，其余步驟同試樣組；空白對照組以蒸餾水分別代替試樣和雙氧水，其余步驟同試樣組，按公式(4)計算·OH清除率。

(4)

式中：A試樣為試樣組的吸光度值，A0為空白組的吸光度值，A空白對照為空白對照組的吸光度值。

豬皮膠原肽不同分子量組分對·OH的清除作用見圖5、6。在實驗范圍內(nèi)(0.3～6 mg·mL-1)，不同分子量豬皮膠原肽酶解組分對·OH均有一定清除作用，且隨濃度的增加清除能力也增加，不同分子量豬皮膠原蛋白肽組分對·OH的清除能力不同，通過比較IC50，各組分清除能力順序為：小于1 kDa組分>1 kDa～3 kDa組分>酶解原液組分>大于3 kDa組分>水提液組分，結(jié)果顯示小于1 kDa組分對·OH的清除力最強(qiáng)，其IC50值為2.195 mg·mL-1。

圖5 豬皮膠原肽各組分對·OH清除作用比較

圖6 豬皮膠原肽各組分清除·OH自由基能力比較

3 討論

本實驗采用仿生酶解技術(shù)酶解新鮮豬皮得到酶解原液，酶解原液經(jīng)超濾得到M<1 kDa、1 kDa3 kDa 3個不同分子量肽段，豬皮經(jīng)水提取得到豬皮水提液，上述5組分分別凍干，得到凍干粉。對豬皮膠原肽5組分進(jìn)行抗氧化性研究，包括對DPPH·自由基、O2-·自由基及·OH自由基的清除實驗。結(jié)果表明，不同分子量的豬皮膠原肽組分均有一定的抗氧化活性，其中M<1 kDa組分的清除活性最強(qiáng)，這一結(jié)果印證了Guillen等[16]研究得出的分子量大小也會影響肽抗氧化活性的結(jié)論。