王 娜，向清豪，趙肖榮，李博生*，聶中良

隨著人口的增長(zhǎng)和生活水平的提高，人們對(duì)蛋白需求也越來(lái)越大，蛋白質(zhì)資源的緊缺已經(jīng)成為世界關(guān)注的焦點(diǎn)。尋找和開(kāi)發(fā)新的蛋白資源已經(jīng)成為我國(guó)食品工業(yè)亟待解決的問(wèn)題[1]。螺旋藻是人類最理想的蛋白源，其蛋白含量高達(dá)藻粉干質(zhì)量的三分之二以上，且均屬于優(yōu)質(zhì)蛋白[2]。螺旋藻中必需氨基酸的組成與聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織規(guī)定的最佳氨基酸組成相吻合[3-4]。近年來(lái)，從藻細(xì)胞中分離出大量的蛋白類生物活性物質(zhì)[5]，其具有抗氧化[6]、抗腫瘤[7]、免疫調(diào)節(jié)[8]等功能。由于螺旋藻具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與獨(dú)特的保健功效而成為全球開(kāi)發(fā)規(guī)模最大的經(jīng)濟(jì)微藻之一[9]。

近年來(lái)，科研工作者對(duì)螺旋藻蛋白的功能及開(kāi)發(fā)利用進(jìn)行了大量的研究。目前，對(duì)于螺旋藻蛋白功能的研究主要集中在抗腫瘤、抗病毒、抗氧化和提高機(jī)體免疫力等方面[10]。螺旋藻的這些功能與其含有的活性蛋白有直接的關(guān)系，如藻膽蛋白[11-13]、超氧化物歧化酶[14]、金屬硫蛋白[15]、熱休克蛋白70[16]、絲氨酸蛋白酶抑制劑[17]均已得到開(kāi)發(fā)并且產(chǎn)品已上市。還有一些活性蛋白處于研究階段，表現(xiàn)出較大應(yīng)用價(jià)值，例如海藻糖合酶[18]和4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶[19]。由此可知，螺旋藻蛋白開(kāi)發(fā)潛力巨大。

目前，對(duì)于螺旋藻全蛋白及其分類的研究鮮見(jiàn)全面的分析研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)相對(duì)和絕對(duì)定量同位素標(biāo)記（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）實(shí)驗(yàn)和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography mass spectrometry，LC-MS/MS）技術(shù)對(duì)螺旋藻的全蛋白組進(jìn)行測(cè)定；采用序列分類法對(duì)蛋白進(jìn)行家族分類，根據(jù)同一家族或超家族具有序列一致性或者結(jié)構(gòu)和功能相似性的特點(diǎn)[20-22]，將螺旋藻蛋白分成不同的蛋白家族或超家族，使序列相似性低但結(jié)構(gòu)和功能具有同源性的不同蛋白家族歸到同一超家族，并對(duì)各超家族中的功能蛋白進(jìn)行研究；通過(guò)對(duì)超家族中的已知蛋白開(kāi)發(fā)利用現(xiàn)狀進(jìn)行分析及未知蛋白功能進(jìn)行推測(cè)，為進(jìn)一步研究螺旋藻活性蛋白開(kāi)闊視野，為螺旋藻的開(kāi)發(fā)利用提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鈍頂螺旋藻（Spirulina platensis）、螺旋藻凍干粉由北京林業(yè)大學(xué)螺旋藻研究所提供；胰蛋白酶美國(guó)Promega公司；乙腈 澳大利亞Merck公司；十二烷基磺酸鈉（sodium laurylsulfonate，SDS）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（trihydroxymethyl aminomethane，Tris-HCl） 、TCA/丙酮提取液美國(guó)Sigma公司；尿素 美國(guó)Urea公司；三甲基碳酸氫鈉、碘乙酰胺、磷酸二氫鉀、氯化鉀 北京化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JAC-IV型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 濟(jì)寧市奧波超聲波電氣有限公司；YXJ-2離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司；LL-1500型真空冷凍干燥機(jī) 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；iTRAQ Reagent-4plex Multiplex Kit（AB SCIEX）試劑盒 上海儲(chǔ)甜生物科技有限公司；C18Cartridges色譜柱（Empore? SPE Cartridges C18（標(biāo)準(zhǔn)密度），長(zhǎng)度7 mm，容量3 mL） 美國(guó)Sigma公司；API 4000 LC-MS/MS聯(lián)用儀 美國(guó)AB SCIEX公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備和保存

取適量螺旋藻凍干粉加入燒杯中，以1∶20的體積比加入蒸餾水配制螺旋藻懸浮液，超聲破碎（功率500 W，間隔1 min，超聲30 min，冰水?。黄扑楹箅x心（8 000 r/min，10 min），收集上清液；然后抽濾，以除去未沉淀的雜質(zhì)，得到的濾液即為螺旋藻全蛋白溶液；最后將此溶液進(jìn)行真空冷凍干燥，得到全蛋白干粉，于冰箱冷藏備用。

1.3.2 蛋白質(zhì)的消化和同位素標(biāo)記（iTRAQ）

取20 μg的蛋白加入到30 μL STD緩沖液（4% SDS，100 mmol/L DTT，150 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0）中，沸水浴5min，冷卻至室溫，加入200 μL UA緩沖液（8 mol/L尿素和150 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0）混勻，轉(zhuǎn)入30 kDa超濾離心管，14 000×g離心15 min；加入100 μL 0.05 mol/L碘乙酰胺暗處理20 min，然后在上述條件下離心10 min，用100 μL UA緩沖液清洗濾波器3 次，再加入100 μL DS緩沖液（50 mmol/L三甲基碳酸氫鈉，pH 8.5）與樣品反應(yīng)10 min，以上過(guò)程重復(fù)2 次。最后，向?yàn)V波器中加入40 μL溶解了2 μg胰蛋白酶的DS緩沖液；將所有樣品在37 ℃的條件下放置過(guò)夜。通過(guò)離心來(lái)收集產(chǎn)生的肽段，濾波器繼續(xù)使用40 μL的DS緩沖液漂洗。選擇iTRAQ Reagent-4plex Multiplex Kit（AB SCIEX）試劑盒進(jìn)行標(biāo)記。

1.3.3 SCX分級(jí)

在進(jìn)行LC-MS/MS分析之前，先通過(guò)強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜（strong cation exchange chromatography，SCX）使用多重標(biāo)記試劑對(duì)肽進(jìn)行純化，將真空干燥的多肽，溶入強(qiáng)陽(yáng)離子交換緩沖液A（10 mmol/L磷酸二氫鉀在25%的CAN中，pH 3.0）中，Polysulfoethyl柱（4.6 mm×100 mm，5 μm，200 μ），選定合適梯度的洗脫液（10 mmol/L磷酸二氫鉀，500 mmol/L氯化鉀在25%的乙腈中，pH 3.0），洗脫速率為1 mL/min。將洗脫下的多肽液用餾分收集器進(jìn)行收集，用C18Cartridges色譜柱進(jìn)行脫鹽，每一個(gè)樣品都進(jìn)行真空濃縮，然后溶解在40 μL體積分?jǐn)?shù)0.1% TCA中。所有樣品在進(jìn)行LC-MS/MS分析前都貯存在-80 ℃保存。

1.3.4 LC-MS/MS分析

1.3.4.1 色譜條件

色譜柱：ChromXP C18（C18-CL，360 μm×0.5 mm，3 μm，120 μ）；上樣量：10 μL；流速：2 μL/min；流動(dòng)相A液：2%乙腈-0.1%甲酸-98%水；流動(dòng)相B液：98%乙腈-0.1%甲酸-2%水；線性洗脫梯度為0～100 min B液0%～50%，100～108 min B液50%～100%，108～120 min B液100%。

1.3.4.2 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜系統(tǒng)：AB SCIEX TripleTOF 5600質(zhì)譜；TOF MS/MS掃描分辨率：30 000；質(zhì)荷比范圍：m/z 350～1 500；累積時(shí)間250 ms。

1.4 數(shù)據(jù)分析

LC-MS/MS得到的數(shù)據(jù)運(yùn)用Proteinpilot Software 4.2直接查庫(kù)分析，本研究使用的數(shù)據(jù)庫(kù)為Uniprot.oscillat orial es. fasta（蛋白質(zhì)序列共125 415 條），查庫(kù)使用ProteinPilot軟件版本為ProteinPilot? Software 4.2。相關(guān)參數(shù)：樣品類型是iTRAQ 4-plex（標(biāo)記肽），使用碘乙酰胺做為半胱氨酸烷基化試劑，用胰蛋白酶進(jìn)行消化處理，選用的檢測(cè)設(shè)備為三重四極桿飛行質(zhì)譜，分析過(guò)程無(wú)特例，自動(dòng)進(jìn)行偏移修正，進(jìn)行全搜索，置信度大于0.05。ProteinPilot結(jié)果過(guò)濾參數(shù)為蛋白錯(cuò)誤率不大于0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 螺旋藻蛋白序列比對(duì)（BLAST）

通過(guò)ProteinPilot軟件處理和UniProtKB數(shù)據(jù)庫(kù)（版本號(hào)：Release_201407）搜索，發(fā)現(xiàn)在螺旋藻中共存在2 085 個(gè)蛋白質(zhì)。每個(gè)蛋白分子在SCOP數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，能夠得到蛋白質(zhì)所處的蛋白家族。再利用一款本地化的序列對(duì)比軟件NCBI BLAST＋（ncbi-blast-2.2.28＋-win32.ext）將由軟件鑒定到的螺旋藻蛋白質(zhì)與NCBI nr數(shù)據(jù)庫(kù)中的相應(yīng)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行對(duì)比，序列比對(duì)結(jié)果如圖1所示。

圖1 序列比對(duì)相似性分布Fig. 1 Sequence similarity distribution

由圖1可見(jiàn)，分析所得的比對(duì)相似性范圍為38%～100%，絕大部分的目標(biāo)蛋白的序列比對(duì)相似性可超過(guò)90%。說(shuō)明所采用的序列分類法可信度高。

2.2 螺旋藻細(xì)胞蛋白組成及分類

由圖2可見(jiàn)，螺旋藻中已知蛋白有1 562 個(gè)，占總蛋白種類的75%左右；未知蛋白有523 個(gè)，占總蛋白種類的25%以上；按照序列分類法歸入蛋白家族的有869 個(gè)，占總蛋白種類的42%，其中已知蛋白有763 個(gè)，未知蛋白有106 個(gè)；未歸入蛋白家族的有1 216 個(gè)，占總蛋白種類的58%，其中已知蛋白有799 個(gè)，未知蛋白有417 個(gè)。869 個(gè)可分類蛋白中已知蛋白與未知蛋白比例約為7∶1，雖然已知蛋白結(jié)構(gòu)和功能已明確，但實(shí)際得到開(kāi)發(fā)并應(yīng)用的卻很少，對(duì)未知蛋白功能的研究更是微乎其微。通過(guò)家族分類將螺旋藻蛋白分為7大超家族，進(jìn)而為分析超家族中已知活性蛋白的開(kāi)發(fā)現(xiàn)狀和推測(cè)未知蛋白的功能指明方向。

圖2 螺旋藻蛋白質(zhì)組的分類Fig. 2 Classification of Spirulina proteome

2.3 螺旋藻蛋白質(zhì)超家族及其功能分析

2.3.1 糖苷酶超家族

糖苷酶超家族成員是由α-螺旋折疊構(gòu)成的三維結(jié)構(gòu)。具有相同三維結(jié)構(gòu)的不同蛋白，其氨基酸序列相似性較低。糖苷酶超家族在自然界物質(zhì)循環(huán)和能量循環(huán)中扮演極其重要的角色[23]，如4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶和海藻糖合酶。來(lái)自于其他生物中的這2 種蛋白酶在抗氧化、改善淀粉結(jié)構(gòu)和作為生物分子保護(hù)劑等[24-26]方面已得到應(yīng)用，但存在于螺旋藻中的這些酶尚未得到開(kāi)發(fā)。

表1 糖苷酶超家族Table 1 Trans glycosidases superfamily

由表1可知，有14 個(gè)蛋白屬于糖苷酶超家族，已知蛋白有11 個(gè)。其中有兩種蛋白基因名稱相同為malQ，均來(lái)源于Arthrospira sp. PCC 8005，它們都由一個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，大小分別為530 個(gè)和503 個(gè)氨基酸，其功能具有相似性，都能把1,4-α-D-葡聚糖的一個(gè)片段轉(zhuǎn)移到受體的新位置上，并能保持4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶的活性；4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶蛋白來(lái)源于Arthrospira platensis C1，由一個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，其大小為505 個(gè)氨基酸，也具有上述功能，通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)該蛋白功能搜索，根據(jù)相似功能域推斷該蛋白可能具有不需要任何輔酶或輔助因子就能催化糖苷鍵水解的活性；而其他8 個(gè)已知蛋白都是由一個(gè)結(jié)構(gòu)域組成且都能參與碳水化合物代謝過(guò)程。該超家族中有3 個(gè)未知蛋白，它們序列相似性低且蛋白序列結(jié)構(gòu)尚未被認(rèn)識(shí)，既然處于同一超家族，那么未知蛋白與已知蛋白具有相似于碳水化合物代謝區(qū)域。

2.3.2 球蛋白超家族

通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索，發(fā)現(xiàn)藻藍(lán)蛋白通過(guò)分類歸入了球蛋白超家族。藻藍(lán)蛋白是目前螺旋藻球蛋白超家族中研究最多的一種蛋白。大量的臨床研究表明，藻藍(lán)蛋白具有抗腫瘤、抗輻射、調(diào)節(jié)免疫力、清除自由基、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)等生理作用[27]。

表2 球蛋白超家族Table 2 Globin-like superfamily

由表2可知，有11 個(gè)蛋白歸入球蛋白超家族。其中命名為cpcB的兩種蛋白在該家族中氨基酸序列一致性高達(dá)93%，都為晶體結(jié)構(gòu)，均來(lái)源于Spirulina fusiformis；命名為N/A的兩種蛋白序列相似性高分別為80%和99%，其晶體結(jié)構(gòu)為α亞基和β亞基，它們靠靜電相互作用形成有部分重疊的“彎月形”單體，3 個(gè)單體圍繞中心軸形成一個(gè)具有中央空洞的圓盤(pán)形三聚體，這兩種蛋白都屬于藻膽蛋白家族，該家族蛋白β亞基的72 位均為經(jīng)過(guò)修飾的γ-N-甲酰天冬酰胺殘基，且在某位點(diǎn)處的氨基酸殘基相當(dāng)保守，并且認(rèn)為這些位點(diǎn)在保證色基的構(gòu)象以及蛋白質(zhì)分子穩(wěn)定性方面具有重要的意義；cpcB1序列一致性為77%，有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，具有參與色素形成的功能；而另外的6 個(gè)蛋白序列一致性很低，但結(jié)構(gòu)相似性卻很高，都能夠參與光合作用。不同蛋白功能的改變來(lái)源于一些特定部位氨基酸的差異，該研究為今后深入探討球蛋白超家族中各蛋白結(jié)構(gòu)、性質(zhì)與功能的關(guān)系的研究提供參考依據(jù)。

2.3.3 熱休克蛋白70 kDa（HSP70）超家族

HSP70超家族中所有成員都含有ATP酶區(qū)和多肽結(jié)合區(qū)組成的共同的結(jié)構(gòu)。ATP酶區(qū)位于蛋白的N端，包括385 個(gè)氨基酸殘基，分子質(zhì)量為44 kDa，此區(qū)域高度保守，具有水解ATP的活性。多肽結(jié)合區(qū)位于蛋白的C端，分子質(zhì)量約27 kDa，由底物結(jié)合域和可變動(dòng)功能域組成，具有結(jié)合未折疊多肽的功能特點(diǎn)。HSP70大約由650 個(gè)氨基酸組成，是一組進(jìn)化上高度保守的應(yīng)激蛋白，而螺旋藻的生長(zhǎng)環(huán)境中鹽堿含量較高，這為分析應(yīng)激性蛋白的表達(dá)和含量的變化提供新的研究領(lǐng)域[28]。

表3 熱休克蛋白70 kDa（HSP70）超家族Table 3 Heat shock protein 70 kDa (HSP70) superfamily

由表3可知，在螺旋藻內(nèi)有4 個(gè)蛋白屬于HSP70超家族，且全為已知蛋白，它們序列相似性極低。其中編號(hào)為K1WRN2的蛋白序列一致性為11%，其余3種蛋白序列相差很大。編號(hào)為K1W408和K1WRN2的兩種蛋白均來(lái)自A. platensis C1，且屬于HSP70家族，該家族蛋白具有功能相關(guān)性，其三維結(jié)構(gòu)是由α-螺旋組成的區(qū)域，具有高度保守鈣調(diào)素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其大小為45 kDa，具有較高的ATP親和性且氨基端具有弱的ATP酶活性，該家族在機(jī)體免疫反應(yīng)中十分重要，具有抗原載體和免疫佐劑作用，成為重組核酸疫苗理想的免疫增強(qiáng)因子，在核酸疫苗研制方面引起了科研人員的重視。

2.3.4 枯草桿菌蛋白酶超家族

表4 枯草桿菌蛋白酶超家族Table 4 Subtilisin-like superfamily

枯草桿菌蛋白酶是一類分子質(zhì)量低于14 kDa的一種堿性蛋白酶，大部分枯草桿菌蛋白酶是由270多個(gè)氨基酸殘基組成[29]，具有良好的耐高溫、耐膽鹽的能力，環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)[30]，在螺旋藻中廣有分布；其酶解能力也很強(qiáng)，能水解蛋白成小分子肽，目前洗滌劑中酶量的90%為枯草桿菌蛋白酶[29]。螺旋藻作為一種天然綠色的原料，還沒(méi)有相關(guān)此類的報(bào)道。因此，對(duì)該家族進(jìn)行多方面的工程研究，具有一定商業(yè)價(jià)值。

由表4可知，螺旋藻中歸入枯草桿菌蛋白酶超家族的蛋白共有8 個(gè)，且全為已知蛋白。AmaxDRAFT_0723在該家族中序列一致性為39%，它有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，其大小分別為270～593 個(gè)和653～738 個(gè)氨基酸。值得注意的是K1WF48和K1X3Z6這兩種蛋白在該家族中序列相似性高達(dá)70%，均來(lái)自A. platensis C1，其中編號(hào)為K1WF48的蛋白具有一個(gè)結(jié)構(gòu)域，其大小為18～258 個(gè)氨基酸；編號(hào)為K1X3Z6的蛋白具有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，其大小分別為277～467 個(gè)和654～885 個(gè)氨基酸。這些蛋白在各自的結(jié)構(gòu)域都具有相似的分子功能，能夠降低絲氨酸型內(nèi)肽酶的活性，而內(nèi)肽酶的活性增強(qiáng)導(dǎo)致植物衰老過(guò)程中蛋白質(zhì)含量降低[31]，因此該家族可能在延緩生物體衰老方面具有重要意義。

2.3.5 硫氧還蛋白超家族

硫氧還蛋白（Trx）超家族中所有蛋白分子質(zhì)量都在12 kDa左右，大都具有-Cys-Gly-Pro-Cys-（-CGPC-）的活性中心位點(diǎn)。活性位點(diǎn)中兩個(gè)半胱氨酸巰基能夠可逆地形成二硫鍵，使Trx具有氧化態(tài)和還原態(tài)兩種存在形式，參與氧化還原反應(yīng)。該超家族蛋白在結(jié)構(gòu)上具有高度的相似性，具有極其牢固的三級(jí)結(jié)構(gòu)，其分子內(nèi)75%以上的氨基酸殘基在空間上形成了互相交錯(cuò)的5 個(gè)β-折疊與4 個(gè)α-螺旋，這些連續(xù)的二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)成了整個(gè)分子的核心。Trx作為一類廣泛存在的熱穩(wěn)定的氫載體蛋白質(zhì)，在以光合作用為生命動(dòng)力的螺旋藻中有著重要的作用[32]。

表5 硫氧還蛋白超家族Table 5 Thioredoxin-like superfamily

由表5可知，有18 個(gè)蛋白歸入硫氧還蛋白超家族，且全為已知蛋白。其中超過(guò)1/2的蛋白序列一致性低于30%，但它們結(jié)構(gòu)具有很高的同源性，都具有抗氧化活性和保持氧化還原酶活性，并能維持細(xì)胞氧化還原的穩(wěn)態(tài)。另外在該超家族中還有少數(shù)幾種蛋白序列一致性相對(duì)較高，它們均來(lái)自A. platensis C1，例如編號(hào)為K1VW14蛋白序列一致性為50%，有一個(gè)結(jié)構(gòu)域，其大小為3～152 個(gè)氨基酸；K1W397序列一致性為68%，具有一個(gè)結(jié)構(gòu)域，其大小為8～104 個(gè)氨基酸，還可以作為電子載體。細(xì)胞中的活性氧是導(dǎo)致生物氧化脅迫的一個(gè)主要方面，Trx可以通過(guò)對(duì)細(xì)胞內(nèi)被氧化的二硫鍵的還原來(lái)修復(fù)機(jī)體的氧化損傷，并通過(guò)這種方式防止機(jī)體衰老。然而，Trx消除活性氧與抑制機(jī)體衰老的分子機(jī)理仍然沒(méi)有得到完全的闡明，因此該超家族為研究機(jī)體衰老提供了一條新思路。

2.3.6 核酸結(jié)合蛋白超家族

核酸結(jié)合蛋白是與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)，其分子質(zhì)量為19 kDa，負(fù)責(zé)DNA分子遺傳信息的復(fù)制和表達(dá)，這類蛋白對(duì)螺旋藻的繁殖和相關(guān)特性遺傳有著重要作用[33]。

表6 核酸結(jié)合蛋白超家族Table 6 Nucleic acid-binding proteins superfamily

由表6可知，共有21 個(gè)已知蛋白歸入核酸結(jié)合蛋白超家族。該超家族蛋白具有相似的結(jié)構(gòu)域，都能與核酸結(jié)合并參與DNA的復(fù)制。PheT序列一致性為31%，具有3 個(gè)結(jié)構(gòu)域，其大小分別為39～150、412～502、723～816 個(gè)氨基酸，屬于苯丙氨酰-tRNA合成酶β亞家族，1型亞科；Rps蛋白的序列同源性很高，有83%序列相似性；其他19 個(gè)蛋白序列一致性都低于30%；另外編號(hào)為K1WHW6、K1WP28和H1WGP9這3 種蛋白都由一個(gè)結(jié)構(gòu)域組成且參與RNA結(jié)合；編號(hào)為K1WPZ1和K1XDJ8這兩種蛋白還參與翻譯的過(guò)程。由此可見(jiàn)，該超家族對(duì)生物體中生命活動(dòng)具有重要意義。

2.3.7 限制性內(nèi)切酶超家族

通過(guò)序列分類法，發(fā)現(xiàn)螺旋藻蛋白中的限制性內(nèi)切酶超家族，該超家族的特點(diǎn)是相對(duì)分子質(zhì)量較小，通常在2×104～10×104之間，一般由2 個(gè)或4 個(gè)相同亞基所組成。限制性內(nèi)切酶能識(shí)別DNA的特異序列，并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA，因此，該蛋白超家族的研究會(huì)對(duì)螺旋藻基因表達(dá)具有重要意義。

表7 限制性內(nèi)切酶超家族Table 7 Restriction endonuclease-like superfamily

由表7可知，共有22 個(gè)蛋白歸入限制性內(nèi)切酶超家族，僅有1 個(gè)已知蛋白。推定的FdxN元件切除控制因子蛋白來(lái)自Arthrospira sp. PCC 8005，序列相似性低，但氨基酸序列完整，結(jié)構(gòu)域只有一個(gè)，由138 個(gè)氨基酸組成，在該結(jié)構(gòu)域中具有維持核酸酶活性并與核酸結(jié)合的功能。其余21 個(gè)蛋白都為未知蛋白，也應(yīng)具有類似已知蛋白的功能。研究表明，某些基因的擴(kuò)增可能與細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)[34]。該超家族有望在腫瘤細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮作用，因此擁有21 個(gè)未知蛋白的該蛋白超家族具有一定研究?jī)r(jià)值。

3 結(jié) 論

螺旋藻蛋白種類繁多、結(jié)構(gòu)各異、功能奇特，因此從全蛋白角度進(jìn)行家族分類十分必要。對(duì)螺旋藻內(nèi)的全蛋白測(cè)定和蛋白質(zhì)家族分類，得到螺旋藻內(nèi)共含有2 085 個(gè)蛋白，基于SCOP蛋白分類數(shù)據(jù)庫(kù)按照序列分類法最終能按照蛋白質(zhì)家族（超家族）分類的蛋白有869 個(gè)，剩下的1 216 個(gè)蛋白質(zhì)則不能按照該法歸入家族。將869 個(gè)可分類蛋白共分成233 個(gè)蛋白超家族和87 個(gè)蛋白家族，其中可分類蛋白中有106 個(gè)未知蛋白歸入了41 個(gè)不同的蛋白超家族。但未能歸入家族的蛋白含量占總蛋白含量的一半左右，而這些未知的功能蛋白同樣存在潛在的開(kāi)發(fā)價(jià)值，以待開(kāi)發(fā)。

螺旋藻蛋白超家族共分為7 大類。1）來(lái)自于螺旋藻糖苷酶超家族中已知蛋白有11 個(gè)，其中α-淀粉酶在食品改良方面已被利用，而其余的10 個(gè)已知蛋白中的4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶可用于制備大環(huán)糊精和糖原，開(kāi)發(fā)潛力巨大；海藻糖合酶可作為生物分子保護(hù)劑，海藻糖的工業(yè)生產(chǎn)最初是通過(guò)微生物發(fā)酵或直接從干酵母中提取，生產(chǎn)成本太高，已逐漸被酶法合成所取代，而螺旋藻可以作為海藻糖合酶的新來(lái)源。另外，該超家族還有3 個(gè)未知蛋白，其與已知蛋白有功能同源性，也應(yīng)及時(shí)對(duì)它們展開(kāi)研究。2）球蛋白超家族共包括11 個(gè)已知蛋白，其中有8 個(gè)蛋白屬于藻膽蛋白，它們?cè)谔烊皇称飞?、醫(yī)藥保健、生物制劑等方面被廣泛應(yīng)用。該超家族蛋白在螺旋藻中的含量豐富且開(kāi)發(fā)利用價(jià)值極高。3）HSP70超家族中包括4 個(gè)已知蛋白，其中分子伴侶DnaK是一種環(huán)境脅迫相關(guān)蛋白，當(dāng)細(xì)胞受到多種環(huán)境脅迫時(shí)，DnaK起著重要作用，在螺旋藻中已經(jīng)得到開(kāi)發(fā)利用，Hsp70-肽疫苗主要參與的是細(xì)胞免疫，能有效激活CTL，可以作為治療性疫苗，這是與普通疫苗的最大區(qū)別。在疫苗研制方面具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。4）枯草桿菌蛋白酶超家族共包括8 個(gè)已知蛋白，其中較為重要的是具有抑制血栓形成的枯草桿菌蛋白酶，而另外7 個(gè)已知蛋白中類枯草桿菌蛋白酶能夠在降低絲氨酸型內(nèi)肽酶的活性、延緩植物衰老方面有利用價(jià)值，值得深入開(kāi)發(fā)研究。5）螺旋藻中還有4 個(gè)蛋白超家族，包括硫氧還蛋白超家族、核酸結(jié)合蛋白超家族、環(huán)核苷三磷酸水解酶超家族和限制性內(nèi)切酶超家族。它們?cè)谑称?、醫(yī)藥、化妝品等方面也具有很大的開(kāi)發(fā)潛能。其中值得研究的是限制性內(nèi)切酶超家族，該超家族22 個(gè)蛋白中僅有1 個(gè)已知蛋白在腫瘤治療的醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用，因此擁有21 個(gè)未知蛋白的該超家族具有極大的開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值。綜上所述，螺旋藻蛋白含量高、蛋白種類豐富。對(duì)螺旋藻蛋白質(zhì)進(jìn)行家族分類研究，根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能同源性將已得到應(yīng)用的活性蛋白分為不同的家族或超家族。結(jié)果顯示還有近一半的活性蛋白未被認(rèn)識(shí)和歸類，這些活性蛋白具有極高的研究?jī)r(jià)值。本研究為進(jìn)一步探討螺旋藻蛋白活性，蛋白組學(xué)的研究提供了新思路，也為螺旋藻資源的開(kāi)發(fā)利用提供一定的參考。