宗緒巖，李 建，彭翠珍，李 麗,*

啤酒糟又稱為麥糟、麥芽糟，是啤酒釀造麥芽糖化的副產(chǎn)物，占啤酒工業(yè)總副產(chǎn)物的85%[1]。啤酒糟中含有麥芽的外殼和殘留的胚乳，富含纖維素、阿拉伯木聚糖、木質(zhì)素和蛋白質(zhì)，是一種低成本食品廢棄物，是良好的膳食纖維源和植物性蛋白質(zhì)源[2]，因此除了用于飼料生產(chǎn)[3]、食用菌培植[4]外，也被用于研發(fā)生產(chǎn)水解多肽、復(fù)合氨基酸[5]等蛋白制品及面包[6]、餅干等休閑食品。由于啤酒糟中蛋白質(zhì)在麥芽汁制備過(guò)程中經(jīng)過(guò)了高溫滅酶處理，蛋白質(zhì)發(fā)生變性，特性也已經(jīng)改變，限制了啤酒糟蛋白的利用。

目前，對(duì)植物蛋白的改性方法主要有化學(xué)改性[7]、物理改性[8]、酶法改性[9]等。酶法改性的方式有多種，通常包括催化蛋白質(zhì)發(fā)生水解作用[10]、共價(jià)交聯(lián)作用、糖基化[11]以及磷酸化[12]等，從而改善蛋白質(zhì)的溶解度及乳化性等功能特性。由于可控性強(qiáng)、條件溫和、耗能少、專一性強(qiáng)及副產(chǎn)物少，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，酶法改性成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)[13]。谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（transglutaminase，TGase）通過(guò)催化蛋白質(zhì)或多肽中谷氨酰胺殘基的γ-羥胺基團(tuán)與Lys上的ε-氨基之間形成共價(jià)鍵，增大蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量，從而改善蛋白質(zhì)的凝膠性、黏彈性、保水性等。胡小中等[14]研究表明對(duì)大豆分離蛋白改性時(shí)，TGase的使用使大豆蛋白的凝膠性及熱穩(wěn)定性能得到顯著改善。朱小燕等[15]研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)TGase改性的米渣蛋白持油性、體外消化率及流變性得到提升。由于啤酒糟中蛋白質(zhì)主要來(lái)源于大麥[16]，含有大量的谷氨酰胺，而大豆蛋白富含Lys，Lys和谷氨酰胺作為T(mén)Gase的作用底物，若將啤酒糟蛋白和大豆蛋白混合進(jìn)行TGase改性，不僅有助于改善蛋白的凝膠性能，平衡其人體必需氨基酸的組成，提高蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，拓寬啤酒糟蛋白的利用價(jià)值和使用范圍。

本實(shí)驗(yàn)采用濕磨法提取、富集啤酒糟蛋白，分析了其氨基酸組成，從而確立了TGase改性啤酒糟蛋白與大豆分離蛋白混合的實(shí)驗(yàn)思路，并采用響應(yīng)面分析法對(duì)改性加工條件進(jìn)行優(yōu)化，提高TGase生物改性效果，從而獲得凝膠性能良好的蛋白產(chǎn)品，研究結(jié)果為拓寬啤酒糟蛋白的應(yīng)用范圍及其精深加工提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

啤酒糟 華潤(rùn)雪花啤酒（內(nèi)江）有限責(zé)任公司；大豆分離蛋白（蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞90%） 益海嘉里（秦皇島）蛋白工業(yè)有限公司；TGase（酶活力100 U/g）泰興市東圣食品有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

多功能膠體磨 溫州昊星機(jī)械設(shè)備制造有限公司；粗（細(xì)）篩子、高效落地高速離心機(jī) 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；H-spray Mini小型噴霧干燥儀北京霍爾斯生物科技有限責(zé)任公司；L-8800全自動(dòng)氨基酸分析儀 日本Hitachi公司；TA.XT Plus物性測(cè)定儀 英國(guó)Stable Mciro System公司；Kjeltec 2200凱氏定氮儀 瑞典FOSS公司。

1.3 方法

1.3.1 啤酒糟蛋白的制備工藝流程[17]

啤酒糟→濕法粉碎→篩分→濾漿→離心→去上清液→復(fù)溶沉淀→噴霧干燥→保存?zhèn)溆?/p>

噴霧干燥條件：進(jìn)風(fēng)溫度165 ℃，進(jìn)風(fēng)量700 L/h，物料質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%，進(jìn)料流量0.4 L/h。

1.3.2 凱氏定氮法測(cè)定啤酒糟蛋白含量[18]

稱取1 g（精確至0.001 g）啤酒糟蛋白樣品于消化管中，加入12 mL濃硫酸及7.8 g混合催化劑（硫酸鉀-硫酸銅質(zhì)量比7∶0.8），放入消化爐中，220 ℃消化0.5 h，420 ℃消化1.5 h后取出冷卻至室溫，上機(jī)測(cè)定蛋白含量。取蛋白質(zhì)換算系數(shù)為6.25。

1.3.3 啤酒糟蛋白氨基酸組成測(cè)定

取3 mL樣品溶液（質(zhì)量濃度1 mg/mL）于安瓿瓶中，加入6 mol/L鹽酸溶液10 mL，滴入幾滴苯酚，充入氮?dú)? min以排出其中的空氣，酒精噴燈，熔化封瓶。將密封樣品在110 ℃條件下徹底水解22 h后，冷藏保存。取出冷卻至室溫。敲瓶，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶，過(guò)濾后取200 μL，與真空干燥箱中減壓干燥。加入1 mL的pH 2.2檸檬酸鈉上機(jī)緩沖溶液稀釋，振蕩，取20 μL上樣。用全自動(dòng)高速氨基酸分析儀進(jìn)行分析，采用柱后茚三酮法測(cè)定樣品中的各種氨基酸含量。

分析條件：柱溫57 ℃；色譜柱日立#26225C型；流動(dòng)相流速1 mL/min；反應(yīng)柱溫135 ℃。

1.3.4 TGase改性混合蛋白工藝

參考文獻(xiàn)[19]，并稍作修改。恒定溶液蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%，配制不同添加量的啤酒糟蛋白與大豆蛋白混合溶液，在室溫條件下攪拌均勻，用1 mol/L的NaOH（或HCl）溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH值為所需值，添加TGase，在所需溫度水浴反應(yīng)一段時(shí)間后，于90 ℃水浴加熱40 min，將制得的樣品放入冰水浴中迅速冷卻，并置于4 ℃冰箱中過(guò)夜，用于凝膠強(qiáng)度的測(cè)定。

1.3.5 凝膠強(qiáng)度測(cè)定

采用質(zhì)構(gòu)儀穿刺實(shí)驗(yàn)法[20]。穿刺實(shí)驗(yàn)操作條件：P 0.5探頭，測(cè)試前速率5.0 mm/s，測(cè)試速率2.0 mm/s，測(cè)試后速率10.0 mm/s，出發(fā)力10 g，下壓凝膠5 mm所需力為凝膠強(qiáng)度[21]。

1.3.6 單因素試驗(yàn)

以混合蛋白凝膠強(qiáng)度為指標(biāo)，分別考察啤酒糟蛋白添加量（10%、20%、30%、40%、50%）、加酶量（5、10、15、20、25 U/g）、水浴溫度（20、30、40、50、60 ℃）、水浴時(shí)間（60、90、120、150、180 min）、初始pH值（5、6、7、8、9）對(duì)混合蛋白凝膠性質(zhì)的影響。單因素試驗(yàn)基本條件為啤酒糟蛋白添加量30%、加酶量15 U/g、水浴溫度50 ℃、反應(yīng)時(shí)間2 h、反應(yīng)pH 7.0。

1.3.7 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，以混合蛋白凝膠強(qiáng)度為響應(yīng)值，以啤酒糟蛋白添加量、水浴溫度、水浴時(shí)間為因變量，設(shè)計(jì)3因素5水平的二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合分析試驗(yàn)，試驗(yàn)重復(fù)6 次，共20 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，試驗(yàn)因素與水平如表1所示。

表1 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels used in quadratic regression orthogonal rotation design

2 結(jié)果與分析

2.1 啤酒糟提取物蛋白質(zhì)含量及氨基酸組成分析

采用凱氏定氮法，重復(fù)測(cè)定3 次后取平均值，測(cè)得蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為52.23%。在1.3.3節(jié)色譜條件下，取標(biāo)準(zhǔn)混合液和樣品溶液各20 μL進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積值，同時(shí)對(duì)樣品進(jìn)行3 次平行測(cè)定。啤酒糟蛋白氨基酸組成如表2所示。

表2 啤酒糟蛋白的氨基酸組成（n=3）Table 2 Amino acid composition of BSG protein (n = 3)

由表2可知，啤酒糟蛋白樣品中共檢測(cè)到17 種氨基酸，氨基酸總量為503.943 mg/g，其中人體必需氨基酸（除Try外）含量為183.972 mg/g，占總氨基酸含量的36.48%，而含量最高的是Glu＋Gln（23.01%），其次是Pro（12.33%）。谷物蛋白中的第1限制氨基酸[22]Lys相對(duì)含量較低，僅4.1%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，啤酒糟蛋白中含有大量的Glu，但Lys含量較低，因此考慮添加富含Lys的大豆蛋白配合TGase改性啤酒糟蛋白，一方面可以為酶交聯(lián)反應(yīng)提供更多的催化位點(diǎn)，提高催化效率，另一方面，可以優(yōu)化蛋白質(zhì)中氨基酸配比。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 啤酒糟蛋白添加量對(duì)混合蛋白凝膠性能的影響

圖1 啤酒糟蛋白添加量對(duì)混合蛋白凝膠強(qiáng)度的影響Fig. 1 Effect of proportion of BSG protein on gel strength of TGase-treated mixed proteins

如圖1所示，當(dāng)啤酒糟蛋白添加量較低時(shí)，隨著添加量的增加，混合蛋白的凝膠強(qiáng)度也增加。當(dāng)添加量超過(guò)30%時(shí)，凝膠強(qiáng)度隨添加量的升高而下降。這可能是因?yàn)殡S著添加量的增加，體系中的非蛋白類物質(zhì)增多，從而使得凝膠強(qiáng)度反而下降。因此，啤酒糟蛋白添加量為30%為宜。

2.2.2 水浴溫度對(duì)混合蛋白凝膠性能的影響

圖2 水浴溫度對(duì)混合蛋白凝膠強(qiáng)度的影響Fig. 2 Effect of bath temperature on gel strength of TGase-treated mixed proteins

如圖2所示，當(dāng)水浴溫度在20～50 ℃時(shí)，混合蛋白的凝膠強(qiáng)度隨水浴溫度的升高呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，當(dāng)水浴溫度超過(guò)50 ℃時(shí)，混合蛋白的凝膠強(qiáng)度急劇下降。溫度的升高可以提高酶的活性，且隨溫度的升高，布朗運(yùn)動(dòng)速率增加，分子相互碰撞的機(jī)會(huì)增加，酶催化效率增大[23]，故混合蛋白的凝膠強(qiáng)度呈現(xiàn)出逐漸增加的趨勢(shì)。當(dāng)溫度繼續(xù)升高，超過(guò)了酶的最適宜溫度時(shí)，酶逐漸失活，導(dǎo)致凝膠強(qiáng)度下降[24]。唐傳核等[25]在研究中發(fā)現(xiàn)，TGase在60 ℃時(shí)幾乎完全失活。本實(shí)驗(yàn)與上述結(jié)論基本相符，選擇水浴溫度為50 ℃。

2.2.3 水浴時(shí)間對(duì)混合蛋白凝膠性能的影響

如圖3所示，隨著水浴時(shí)間的延長(zhǎng)，混合蛋白的凝膠強(qiáng)度先上升后降低，在120 min時(shí)達(dá)到最大值。反應(yīng)時(shí)間是影響酶促反應(yīng)的重要因素[26]，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，TGase催化反應(yīng)趨于完全，并且有一定的水分析出，而維持蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定性所需要的共價(jià)鍵數(shù)目具有一定的飽和性[27]，因而反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)反而使得凝膠強(qiáng)度降低。因此，選擇水浴時(shí)間為120 min為宜。

圖3 水浴時(shí)間對(duì)混合蛋白凝膠強(qiáng)度的影響Fig. 3 Effect of heating time on gel strength of TGase-treated mixed proteins

2.2.4 初始pH值對(duì)混合蛋白凝膠性能的影響

圖4 初始pH值對(duì)混合蛋白凝膠強(qiáng)度的影響Fig. 4 Effect of initial pH on gel strength of TGase-treated mixed proteins

如圖4可知，隨著初始pH值的升高，混合蛋白的凝膠強(qiáng)度呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，在pH 6～8時(shí)TGase均表現(xiàn)出較好的催化效果。當(dāng)pH值大于8時(shí)，混合蛋白的凝膠強(qiáng)度開(kāi)始下降，這可能是因?yàn)檫^(guò)高的pH值使得TGase發(fā)生空間構(gòu)象的改變而部分失活所致[28]。因此，選擇反應(yīng)初始pH值為7。

2.2.5 加酶量對(duì)混合蛋白凝膠性能的影響

圖5 加酶量對(duì)混合蛋白凝膠強(qiáng)度的影響Fig. 5 Effect of TGase dosage on gel strength of TGase-treated mixed proteins

如圖5所示，隨著TGase添加量的增多，混合蛋白的凝膠強(qiáng)度也隨之呈先上升后平穩(wěn)的趨勢(shì)。江波等[29]指出，由于TGase體系中可能存在水解酶，添加量過(guò)高反而會(huì)影響凝膠的形成。因此，選擇加酶量為15 U/g為宜。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

利用Design-Expert 8.0軟件的中心組合設(shè)計(jì)，以啤酒糟蛋白添加量、水浴時(shí)間、水浴溫度為響應(yīng)變量，混合蛋白凝膠強(qiáng)度為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果如表3所示，對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析和響應(yīng)面分析，回歸分析結(jié)果如表4所示，響應(yīng)面和等高線如圖6所示。得到以混合蛋白凝膠強(qiáng)度為響應(yīng)值的回歸方程為：凝膠強(qiáng)度＝214.46＋8.82A-12.16B＋8.11C＋12.25AB-9.5AC-3.25BC-26.52A2-22.81B2-6.19C2。

表3 中心組合試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 3 Central composite design with response variable

表4 回歸方程方差分析Table 4 Analysis of variances for the developed regression equation

由表4可知，模型的F值為32.6，P值小于0.000 1，表明該模型達(dá)到了極顯著水平；失擬項(xiàng)差異不顯著（P=0.392 6＞0.05），這表明模型無(wú)失擬因素存在，能較好地反映實(shí)際情況；試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臎Q定系數(shù)R2值為0.967 0，說(shuō)明混合蛋白凝膠強(qiáng)度的檢測(cè)結(jié)果與模型預(yù)測(cè)結(jié)果有著良好的一致性，試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷男Ｕ禂?shù)R2Adj值為0.937 4，這表明試驗(yàn)結(jié)果有93.74%受所選試驗(yàn)因素的影響。因此，該模型可以較好地對(duì)混合蛋白凝膠強(qiáng)度進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。各因素對(duì)混合蛋白凝膠強(qiáng)度影響的大小順序?yàn)锽＞A＞C，即水浴溫度對(duì)混合蛋白的凝膠強(qiáng)度的影響最大，其次是啤酒糟蛋白添加量，最后是水浴時(shí)間。由回歸方程和方差分析可知，模型中一次項(xiàng)A、B、C對(duì)混合蛋白凝膠強(qiáng)度的影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）；模型中交互項(xiàng)AB對(duì)混合蛋白凝膠強(qiáng)度的影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），AC對(duì)混合蛋白凝膠強(qiáng)度的影響達(dá)到顯著水平（P＜0.05）；模型中二次項(xiàng)A2、B2對(duì)混合蛋白凝膠強(qiáng)度的影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），C2對(duì)混合蛋白凝膠強(qiáng)度的影響達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。

2.4 響應(yīng)面分析及模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖6 各因素交互作用的響應(yīng)面Fig. 6 Response surface plots showing the interactive effects of various factors on gel strength of modified proteins

響應(yīng)面圖是回歸方程的形象描述，能夠直觀反映各個(gè)因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系以及兩因素間交互作用的類型[30-31]。響應(yīng)面圖的等高線呈橢圓形、密集、曲面坡度陡峭則表示兩因素交互影響大，而等高線呈圓形、稀疏、曲面坡度平緩則與之相反[32]。由圖6可知，啤酒糟蛋白添加量與水浴溫度、水浴時(shí)間等高線為橢圓形，這表明啤酒糟蛋白添加量與水浴溫度、水浴時(shí)間對(duì)混合蛋白凝膠強(qiáng)度的影響交互作用顯著。而水浴時(shí)間與水浴溫度等高線雖為橢圓形，但較接近圓形，這表明兩者間有一定的交互作用，但交互效應(yīng)較弱；觀察沿坐標(biāo)軸方向等高線疏密情況可知，在兩兩交互作用中，對(duì)于混合蛋白凝膠強(qiáng)度的影響：水浴溫度＞啤酒糟蛋白添加量＞水浴時(shí)間，這與表4方差分析結(jié)果一致。

利用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化組合，得到TGase改性大豆與啤酒糟混合蛋白的最佳工藝條件為啤酒糟蛋白添加量29.72%、水浴溫度48.26 ℃、水浴時(shí)間131.84 min，此時(shí)酶改性所得混合蛋白的凝膠強(qiáng)度最高，達(dá)到219.611 g。考慮到實(shí)際情況，將最佳處理?xiàng)l件修改為啤酒糟蛋白添加量30%、水浴溫度48 ℃、水浴時(shí)間132 min，在此優(yōu)化條件下進(jìn)行3 次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)平均值為218.55 g，與預(yù)測(cè)值總體吻合，說(shuō)明采用響應(yīng)面優(yōu)化TGase改性混合蛋白的處理?xiàng)l件是可行的，所得優(yōu)化工藝條件較可靠。

3 結(jié) 論

以啤酒糟為原料，通過(guò)濕磨法對(duì)其中蛋白質(zhì)進(jìn)行提取富集，并分析了所得蛋白質(zhì)的氨基酸組成，確立了TGase對(duì)啤酒糟蛋白與大豆蛋白混合改性的實(shí)驗(yàn)思路。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇啤酒糟蛋白添加量、水浴溫度、水浴時(shí)間進(jìn)行中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，使用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，得到TGase改性最佳處理?xiàng)l件為啤酒糟蛋白添加量30%、加酶量15 U/g、反應(yīng)pH 7、水浴溫度48 ℃、水浴時(shí)間132 min，在此處理?xiàng)l件下，所得改性后蛋白質(zhì)的凝膠強(qiáng)度為218.55 g。通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所得實(shí)際值與模型預(yù)測(cè)值接近，證明應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化TGase改性啤酒糟蛋白與大豆蛋白混合是準(zhǔn)確可行的，對(duì)于拓寬啤酒糟蛋白的適用范圍具有重要意義。