朱振元，于曉鳳，賈長(zhǎng)英，冀英萍

蛹蟲草（Cordyceps militaris (L.)）又名為北冬蟲夏草，隸屬于真菌界、子囊菌亞門（Ascomycotina）、核菌綱（Pyrenomycetes）、肉座菌目（Hypocreales）、麥角菌科（Clavicipitaceae）、蟲草屬（Cordyceps），是蟲草屬的模式種[1]。其寄主主要是蟲草蝙蝠蛾和鞘翅目等幼蟲及昆蟲蛹體[2-3]。蛹蟲草具有多種藥理功效，其主要功效成分有蟲草多糖、蟲草酸、蟲草素、超氧化物歧化酶（superoxide dismutas，SOD）、黃酮類、麥角甾醇等[4-5]，其種類和含量在一定程度上決定了蛹蟲草具有抗癌、抗病毒、抗疲勞、抑制炎癥、免疫調(diào)節(jié)、降糖降脂和護(hù)肝等功效[6-9]。大米是日常生活中常生活中的主食之一。以大米為培養(yǎng)基發(fā)酵蟲草具有很大的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，但目前相關(guān)研究不是很多。樸美子等[10]將蟲草菌絲體加入以大米為基質(zhì)的固體培養(yǎng)基，發(fā)酵得到含有蟲草功能性成分的蟲草米，并證明其具有一定免疫活性。本實(shí)驗(yàn)組前期[11]以大米為培養(yǎng)基，對(duì)蟲草發(fā)酵前后的營(yíng)養(yǎng)和功能成分變化及體外抗氧化活性進(jìn)行了研究。本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，對(duì)蟲草米發(fā)酵條件優(yōu)化及其發(fā)酵產(chǎn)物的體內(nèi)抗衰老作用進(jìn)行研究，旨在為進(jìn)一步開發(fā)利用蟲草米提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米為市售；蛹蟲草菌種為天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院生物資源與功能性食品實(shí)驗(yàn)室提供，菌株標(biāo)號(hào)為ZZYYS。

野生型Oregon K品系黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）由天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院食品添加劑與營(yíng)養(yǎng)調(diào)控研究室提供。

3,5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；蟲草酸 北京索萊寶科技有限公司；高碘酸鉀、乙酸銨、L-鼠李糖、乙腈 天津市江天化工技術(shù)有限公司；α-淀粉酶 天津市諾奧科技發(fā)展有限公司；SOD試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、丙二醛（malonaldehyde，MDA）試劑盒南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

JR-2集熱式磁力加熱攪拌器 天津歐諾儀器儀表有限公司；TGL-16B臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；HS3120超聲儀 上海雷勃分析儀器有限公司；LS-B50L型立式壓力蒸汽滅菌器 上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司；SP-2102UV紫外-可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；HYG-IIa回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜 上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司；LC-10ATVP高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 蟲草米發(fā)酵條件優(yōu)化

1.3.1.1 接種及培養(yǎng)

將蛹蟲草斜面菌種接種到PDA培養(yǎng)基[12-13]中進(jìn)行活化后，用接種針取約1.0 cm2的蛹蟲草斜面菌種于種子培養(yǎng)基，22 ℃培養(yǎng)3 d[14]。在無菌操作臺(tái)中以10%的接種量將種子液接至基礎(chǔ)培養(yǎng)基，于150 r/min的恒溫?fù)u床中，22 ℃培養(yǎng)4 d[11]。

稱取30 g大米裝入錐形瓶中，加一定比例的蒸餾水浸泡1 h左右，121 ℃條件下滅菌20 min，冷卻。在無菌操作臺(tái)中接入一定體積的液體菌種，放入一定溫度及濕度的培養(yǎng)箱中，避光培養(yǎng)，空氣為60%，至菌絲吃透固體養(yǎng)料，暗發(fā)酵結(jié)束。培養(yǎng)瓶長(zhǎng)滿菌絲后，將其放于200 lx的散射光環(huán)境中，每天光照12 h促進(jìn)轉(zhuǎn)色，濕度保持不變，約1 周后，白色菌絲轉(zhuǎn)為橘黃色，轉(zhuǎn)色結(jié)束[15]。

1.3.1.2 蟲草米發(fā)酵單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)

選擇料水比、接種量（以大米干基為基準(zhǔn)）、發(fā)酵溫度及避光發(fā)酵時(shí)間為試驗(yàn)對(duì)象，保持其他條件不變，22 ℃培養(yǎng)9 d，為分別測(cè)定在不同水平下蟲草米中蟲草酸、水溶性非淀粉多糖（water-soluble nonstarch polysaccharides，SNSP）含量，設(shè)3 組平行試驗(yàn)，測(cè)其平均值。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上確定正交試驗(yàn)各因素的范圍，以正交試驗(yàn)（表1）確定蟲草米發(fā)酵條件的最佳條件。

1.3.2 蟲草素含量測(cè)定

1.3.2.1 蟲草素的提取

蟲草米粉1.000 0 g，加入蒸餾水40 mL，超聲功率100 W，于60 ℃提取50 min，在4 000 r/min條件下離心15 min，取上清液，重復(fù)操作3 次，合并上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至一定體積，蒸餾水定容到100 mL。將溶液稀釋到合適濃度，過0.45 μm濾膜后進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)。

1.3.2.2 測(cè)定條件

選用高效液相色譜法測(cè)定蟲草米中的蟲草素含量[16]。色譜條件：色譜柱采用C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-水體積比15∶85，檢測(cè)波長(zhǎng)259 nm，柱溫為30 ℃，流速為1 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 蟲草米體內(nèi)抗衰老實(shí)驗(yàn)

在前人研究的基礎(chǔ)上稍作改進(jìn)[17-18]，分別配制兩種果蠅培養(yǎng)基。果蠅基礎(chǔ)培養(yǎng)基：玉米粉72 g，無水葡萄糖72 g，干酵母粉10 g，瓊脂粉6 g，防腐劑（含1%對(duì)羥基苯甲酸乙酯的75%乙醇液）40 mL及蒸餾水750 mL；實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基：分別將基礎(chǔ)培養(yǎng)基中25%、50%、75%的玉米粉替換成相應(yīng)質(zhì)量的蟲草米粉，另將50%的玉米粉替換成相應(yīng)質(zhì)量的大米粉作為大米對(duì)照組。

1.3.3.1 果蠅壽命實(shí)驗(yàn)

收集3 d內(nèi)羽化的雌雄果蠅各1 000 只，隨機(jī)分為5 組雄果蠅及5 組雌果蠅，雌雄組分別設(shè)空白對(duì)照組、大米對(duì)照組、蟲草米低劑量組、中劑量組及高劑量組。每組10 個(gè)培養(yǎng)管，每管20 只果蠅[19]。放于25 ℃、相對(duì)濕度60%左右的濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3 d換新鮮培養(yǎng)基，記錄果蠅死亡數(shù)目直至全部果蠅死亡，計(jì)算果蠅半數(shù)死亡期（每組中半數(shù)果蠅死亡的平均時(shí)間），最高壽命（即每組中最后死亡的20 只果蠅存活時(shí)間的平均數(shù)）及平均壽命（每組全部果蠅死亡時(shí)間的平均數(shù)）。實(shí)驗(yàn)過程中因過度麻醉、轉(zhuǎn)管時(shí)飛走、培養(yǎng)基黏住等偶然因素死亡的果蠅數(shù)目不計(jì)。

1.3.3.2 果蠅抗氧化酶活性實(shí)驗(yàn)

由上述果蠅壽命實(shí)驗(yàn)方法收集雌雄果蠅各1 000 只，以上述方法分別將雌雄果蠅分成5 組，飼養(yǎng)果蠅至40 d時(shí)，各收集一半的果蠅，使其餓2 h，用氮?dú)庵聲?，稱質(zhì)量，按1∶49（mg/mL）比例加生理鹽水，冰浴條件下勻漿，得到2%的果蠅組織勻漿液，隨后在4 ℃條件下2 500 r/min離心10 min，取上清液[20-21]。測(cè)定各管組織液的總蛋白含量[22]，按照試劑盒中說明書指示的方法分別測(cè)各管總SOD活力（黃嘌呤氧化酶法）、CAT活力（紫外分光光度法）以及脂質(zhì)的過氧化產(chǎn)物MDA含量（硫代巴比妥酸法），SOD和CAT活性以相對(duì)酶活力表示，單位為U/mg，MDA含量用1 mg蛋白中的物質(zhì)的量表示，單位為nmol/mg。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟲草米發(fā)酵條件優(yōu)化

2.1.1 料水比的選擇

圖1 料水比對(duì)蟲草酸和SNSP含量的影響Fig. 1 Effect of material to water ratio on the contents of cordycepic acid and SNSP

固體培養(yǎng)基中，料水比關(guān)系到菌種生長(zhǎng)環(huán)境的濕度。料液比過高與過低，都會(huì)影響到菌絲體的生長(zhǎng)代謝[23]，進(jìn)而影響固體基質(zhì)中蟲草酸和SNSP的積累。如圖1所示，料水比對(duì)蟲草酸和SNSP的影響趨勢(shì)較一致，隨著溶劑用量增加，蟲草米中蟲草酸及SNSP含量均呈先升高后下降趨勢(shì)，料水比為1∶1.0，兩種成分含量均達(dá)到最高值，分別為11.55 mg/g、7.42%，溶劑用量過低時(shí)大米固體培養(yǎng)基較干，不適合菌種發(fā)酵[24]；溶劑用量過高則大米黏性較大，易結(jié)塊，透氣性差，使菌絲體的供氧量降低，菌絲體只在表面生長(zhǎng)，難以滲透到基質(zhì)內(nèi)部，導(dǎo)致發(fā)酵不徹底。

2.1.2 接種量的選擇

圖2 接種量對(duì)蟲草酸與SNSP含量的影響Fig. 2 Effect of inoculum concentration on the contents of cordycepic acid and SNSP

接種量的多少直接影響了菌種在發(fā)酵基質(zhì)中的生長(zhǎng)快慢[25-26]。接種量過少，菌絲體發(fā)酵慢，生產(chǎn)效率降低；接種量增加，菌絲體的生長(zhǎng)速率加快，且降低染菌風(fēng)險(xiǎn)，但接種量過高會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵進(jìn)程中產(chǎn)生的代謝廢物增加，影響到其他代謝物的產(chǎn)生[27-28]。如圖2所示，隨著接種量增大，蟲草米中蟲草酸和SNSP含量升高，接種量為20 mL/100 g時(shí)，兩種成分分別高達(dá)17.12 mg/g、7.76%，接種量繼續(xù)增加兩種成分含量反而降低，可能是由于接種量過大，菌絲開始生長(zhǎng)較快，容易在基質(zhì)表面形成菌膜導(dǎo)致內(nèi)部菌絲生長(zhǎng)受限[29]。

2.1.3 發(fā)酵溫度的選擇

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)蟲草酸與SNSP含量的影響Fig. 3 Effect of fermentation temperature on the contents of cordycepic acid and SNSP

蛹蟲草菌種在中低溫的環(huán)境下生長(zhǎng)適宜，自然條件下，20 ℃左右促使其萌發(fā)，溫度過高影響蟲草正常生長(zhǎng)代謝活動(dòng)，而在過低的環(huán)境中，不利于菌絲體的形成及活性組分的產(chǎn)生[30]。圖3表明，培養(yǎng)溫度在18～22 ℃期間，蟲草酸及SNSP含量隨著溫度的升高逐漸增加，22 ℃左右達(dá)到最高值，分別為17.07 mg/g、7.79%。24 ℃時(shí)與22 ℃條件下差別不太明顯，但溫度繼續(xù)上升到26 ℃時(shí)，兩種成分含量均明顯下降。說明在一定范圍內(nèi)，溫度升高，蟲草菌活性增強(qiáng)，超過菌種最適宜溫度，菌種體內(nèi)酶活性降低[31]，代謝速率減慢，兩種物質(zhì)含量隨之減少。

2.1.4 避光發(fā)酵時(shí)間的選擇

圖4 避光發(fā)酵時(shí)間對(duì)蟲草酸與SNSP含量的影響Fig. 4 Effects of fermentation time on the contents of cordycepic acid and SNSP

菌種避光發(fā)酵時(shí)間的長(zhǎng)短，影響菌種代謝活性，關(guān)系著發(fā)酵產(chǎn)物的多少[32]。在一定時(shí)間內(nèi)，代謝產(chǎn)物隨避光發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷積累，但時(shí)間過長(zhǎng)，代謝產(chǎn)物不僅積累速度降低，而且可能伴隨著代謝產(chǎn)物的分解，給生產(chǎn)帶來不利，所以，要嚴(yán)格控制避光發(fā)酵時(shí)間。如圖4所示，蟲草酸含量在發(fā)酵8～9 d時(shí)含量達(dá)到最高值，而SNSP質(zhì)量分?jǐn)?shù)在發(fā)酵9～10 d時(shí)最高，兩者均隨著時(shí)間延長(zhǎng)先增加后降低，均在發(fā)酵9 d左右時(shí)產(chǎn)量較高，最高分別可達(dá)到17.87 mg/g、7.91%。避光發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，菌絲老化的情況明顯，相關(guān)酶活降低，兩種功能成分的含量出現(xiàn)降低現(xiàn)象。

2.1.5 蟲草米發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果

表2 發(fā)酵正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Orthogonal array design with response variables

表3 蟲草酸含量的方差分析Table 3 Analysis of variance for the effect of fermentation conditions on cordycepic acid content

表4 SNSP質(zhì)量分?jǐn)?shù)的方差分析Table 4 Analysis of variance for the effect of fermentation conditions

由表2可以看出，對(duì)蟲草酸含量4 個(gè)因素的最佳組合為A2B2C2D3；而對(duì)蟲草米中SNSP質(zhì)量分?jǐn)?shù)最佳組合為A2B2C2D1。由表3可知，各因素對(duì)蟲草酸含量影響大小依次為料水比、接種量、發(fā)酵溫度、避光發(fā)酵時(shí)間，接種量和料水比具有顯著性影響，另外兩種因素?zé)o顯著性。由表4可知，對(duì)蟲草米中SNSP質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響的顯著順序依次為接種量、發(fā)酵溫度、料水比、避光發(fā)酵時(shí)間，接種量和料水比及發(fā)酵溫度具有顯著性差異，避光發(fā)酵時(shí)間無顯著性差異，與正交試驗(yàn)結(jié)果一致。兩種指標(biāo)的前3 個(gè)因素條件和水平相同，最后一個(gè)因素為避光發(fā)酵時(shí)間，當(dāng)以蟲草酸含量為指標(biāo)時(shí)最佳避光發(fā)酵時(shí)間為10 d；而以SNSP質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)時(shí)最佳避光發(fā)酵時(shí)間為8 d。而因?yàn)楸芄獍l(fā)酵時(shí)間顯著性不高，且為了節(jié)約時(shí)間成本，以經(jīng)濟(jì)效益為主時(shí)選擇時(shí)間相對(duì)較短的因素8 d。故以SNSP質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)的最佳指標(biāo)為準(zhǔn)。綜合以上因素，最終蟲草米發(fā)酵優(yōu)化條件為：料水比1∶1.0、接種量20 mL/100 g、發(fā)酵溫度22 ℃、避光發(fā)酵時(shí)間8 d。

2.2 蟲草素含量

蟲草素標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為y＝69.044x-29.439（R2＝0.999 9），其中y為峰面積，x為樣品中蟲草素含量。由公式求出蟲草米中蟲草素含量為（8.76±0.56）mg/g。

2.3 蟲草米體內(nèi)抗衰老實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 蟲草米對(duì)果蠅壽命影響

由表5可知，與大米對(duì)照組相比，蟲草米低、中、高劑量組的雌、雄果蠅的半數(shù)死亡期、平均壽命和最高壽命均有延長(zhǎng)，且隨著劑量的增加而增高，即存在量效關(guān)系。低、中、高劑量組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。低劑量組的雌雄果蠅的平均壽命和最高壽命與大米對(duì)照組有顯著差異，而中、高劑量組的雌雄果蠅的半數(shù)死亡期、平均壽命、最高壽命與大米對(duì)照組有極顯著差異，說明蟲草米在一定程度上可以延長(zhǎng)果蠅的壽命。通過雌雄的壽命對(duì)比還可以發(fā)現(xiàn)，雌果蠅的半數(shù)死亡期、平均壽命及最高壽命整體上比雄果蠅增長(zhǎng)快，說明蟲草米對(duì)雌果蠅的壽命影響高于雄果蠅。

表5 不同蟲草米添加量對(duì)果蠅壽命的影響Table 5 Effects of C. militaris (L.) Fr.-fermented rice on the lifespan of D. melanogaster

2.3.2 蟲草米對(duì)雌果蠅體內(nèi)氧化水平影響

表6 不同蟲草米添加量對(duì)雌果蠅中抗氧化酶活性和MDA含量的影響Table 6 Effects of different dietary supplementation levels of C. militaris (L.) Fr.-fermented rice on antioxidant enzyme activities and MDA content in female D. melanogaster

由表6可知，與空白對(duì)照組及大米對(duì)照組相比，蟲草米低、中、高劑量組的雌果蠅體內(nèi)的SOD活性、CAT活力均明顯提高，差異極顯著（P＜0.01）。劑量組隨著劑量的增大兩種酶活力增強(qiáng)，呈現(xiàn)量效關(guān)系。蟲草米高劑量組的雌果蠅體內(nèi)SOD、CAT活性別高達(dá)61.98、17.52 U/mg。雌果蠅體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量隨蟲草米量的增加而降低，且呈量效關(guān)系。與大米對(duì)照組相比，低、中、高劑量組均表現(xiàn)出極顯著性差異。高劑量組果蠅體內(nèi)的MDA含量低至1.36 nmol/mg。

2.3.3 蟲草米對(duì)雄果蠅體內(nèi)氧化水平影響

表7 不同蟲草米添加量對(duì)雄果蠅中抗氧化酶活性和MDA含量的影響Table 7 Effects of different dietary supplementation levels of C. militaris (L.) Fr.-fermented rice on antioxidant enzyme activities and MDA content in male D. melanogaster

由表7可看出，雄性果蠅組織總SOD、CAT活性隨培養(yǎng)管中蟲草米添加量的增加而不斷增加。與空白對(duì)照組及大米對(duì)照組相比雄果蠅體內(nèi)的SOD、CAT活性明顯升高，MDA含量逐漸降低。中、高劑量組的雄果蠅機(jī)體的SOD、CAT活性及MDA含量與大米對(duì)照組相比，均呈顯著性極差異（P＜0.01）。高劑量組的雄性果蠅，體內(nèi)的SOD、CAT活性分別61.78、17.47 U/mg，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的含量降低至1.33 nmol/mg。

3 結(jié) 論

本研究主要目的是通過蟲草菌固態(tài)發(fā)酵普通大米，得到具有較高蟲草酸和SNSP含量的蟲草米。經(jīng)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定了固體發(fā)酵蟲草米的最佳條件為料水比1∶1.0、接種量20 mL/100 g、發(fā)酵溫度22 ℃、避光發(fā)酵時(shí)間8 d。體內(nèi)抗衰老實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同添加量條件下飼養(yǎng)的果蠅的半數(shù)死亡期、平均壽命、最高壽命均高于空白對(duì)照組和大米對(duì)照組；實(shí)驗(yàn)組的果蠅體內(nèi)的SOD活性、CAT活性均高于對(duì)照組，且隨著蟲草米添加量的增大，酶活性增強(qiáng)；實(shí)驗(yàn)組果蠅體內(nèi)的MDA含量較空白對(duì)照組減少，且隨蟲草米添加量的增加而降低。研究結(jié)果表明蟲草米具有一定延緩衰老的作用。