朱彥祺，郭全友*，姜朝軍，李保國(guó)*

大黃魚(yú)（Pseudosciaena crocea）是我國(guó)地方性海水魚(yú)類(lèi)，在我國(guó)漁業(yè)經(jīng)濟(jì)中占據(jù)重要地位[1-2]。大黃魚(yú)多以鮮魚(yú)出口、內(nèi)銷(xiāo)或制成輕腌大黃魚(yú)流通，生鮮制品已成為大黃魚(yú)產(chǎn)品最常用的運(yùn)輸和消費(fèi)途徑。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織調(diào)查，捕獲的魚(yú)類(lèi)大約有30%～50%在食品供應(yīng)鏈的不同環(huán)節(jié)發(fā)生損失，主要是由于水產(chǎn)品的運(yùn)輸、貯藏條件要求高，環(huán)境和溫度的波動(dòng)對(duì)其貨架期影響大[3]。

影響大黃魚(yú)貨架期的主要因素是微生物的生長(zhǎng)代謝作用[4-6]。在微生物的作用下，魚(yú)體中的蛋白質(zhì)、氨基酸及其他含氮物質(zhì)被分解，會(huì)產(chǎn)生氨、胺類(lèi)、硫化物、醇類(lèi)、醛類(lèi)、酮類(lèi)、有機(jī)酸和其他小分子產(chǎn)物，導(dǎo)致魚(yú)體腐敗變質(zhì)。造成魚(yú)變質(zhì)的主要微生物稱(chēng)作優(yōu)勢(shì)腐敗菌[7]，腐敗菌的生長(zhǎng)受到營(yíng)養(yǎng)成分、水分活度、pH值、貯藏溫度、相對(duì)濕度、環(huán)境氣體等影響[8]。微生物的生長(zhǎng)繁殖和自我修復(fù)都需要消耗營(yíng)養(yǎng)來(lái)維持內(nèi)部平衡，營(yíng)養(yǎng)成分的缺失會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢、失活、死亡[9]。碳源作為微生物生長(zhǎng)的六大要素之一，對(duì)微生物的生長(zhǎng)繁殖有很大影響，研究微生物對(duì)碳源的利用情況，分析其差異性對(duì)抑制微生物生長(zhǎng)，延長(zhǎng)貨架期具有指導(dǎo)作用。其中Biolog檢測(cè)系統(tǒng)可以研究微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分碳源的利用程度，探索微生物群體水平的生理功能和代謝功能的多樣性，可作為控制腐敗微生物生長(zhǎng)的有效方法，目前有郭全友等[10]對(duì)魚(yú)源莓實(shí)假單胞菌的碳源利用進(jìn)行了分析，對(duì)淡腌青魚(yú)中木糖葡萄球菌的碳源代謝能力進(jìn)行了研究[11]，但鮮見(jiàn)對(duì)同種特定產(chǎn)品中優(yōu)勢(shì)腐敗菌碳源利用差異性的分析。

最大比生長(zhǎng)速率和延滯期是反映微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的主要參數(shù)，最大比生長(zhǎng)速率反映微生物生長(zhǎng)的快慢，延滯期表示細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境的能力，是描述微生物生長(zhǎng)及貨架期預(yù)測(cè)的主要指標(biāo)，通常使用Gompertz模型進(jìn)行參數(shù)擬合運(yùn)算，得到相應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)，建立微生物生長(zhǎng)模型。許鐘等[12]建立了冷藏羅非魚(yú)特定腐敗菌在0、5、10、15 ℃的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)Gompertz模型，可實(shí)時(shí)預(yù)測(cè)0～15 ℃貯藏羅非魚(yú)的微生物量和剩余貨架期。焦維楨等[13]建立了真空包裝鱘魚(yú)在冷藏過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌的生長(zhǎng)Gompertz預(yù)測(cè)模型，為延長(zhǎng)貨架期提供參考依據(jù)。但微生物碳源利用過(guò)程生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的研究甚少，對(duì)Biolog檢測(cè)結(jié)果使用Gompertz模型擬合，得到其動(dòng)力學(xué)參數(shù)，可知該種碳源是否為其生長(zhǎng)所需碳源及其利用程度，相關(guān)模型可為優(yōu)化產(chǎn)品配方、有效抑制細(xì)菌活動(dòng)提供參考。

本研究以新鮮大黃魚(yú)作為研究對(duì)象，在常用運(yùn)輸貯藏溫度5、25 ℃條件下確定其貨架期，分離優(yōu)勢(shì)腐敗菌，使用Biolog檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)優(yōu)勢(shì)腐敗菌對(duì)碳源利用率，并運(yùn)用Gompertz模型擬合確定其碳源利用代謝的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，反映細(xì)菌能夠利用的底物種類(lèi)以及對(duì)于底物的利用代謝水平和生長(zhǎng)情況，探索新鮮大黃魚(yú)不同溫度下優(yōu)勢(shì)腐敗菌對(duì)碳源利用、動(dòng)力學(xué)的差異性，為調(diào)控大黃魚(yú)在生產(chǎn)貯藏運(yùn)輸中抑菌因子、延長(zhǎng)新鮮大黃魚(yú)的貨架期提供實(shí)驗(yàn)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮大黃魚(yú)（每條約（450±50）g） 上海東方國(guó)際水產(chǎn)中心；Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；胰蛋白大豆瓊脂（TSA）培養(yǎng)基、高氯酸（分析純）、甲醇（優(yōu)級(jí)純）、氫氧化鈉、硫代巴比妥酸、硼酸 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；BUG培養(yǎng)基、Protrol A接種液、GEN-3鑒定板 美國(guó)Biolog公司；叔丁基甲基醚（優(yōu)級(jí)純）德國(guó)Sigma公司；鹽酸溶液（0.01 mol/L） 深圳博林達(dá)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

微生物鑒定儀 美國(guó)Biolog公司；MIDI微生物脂肪酸鑒定儀 美國(guó)安捷倫公司；PCR擴(kuò)增儀（PCR System 9700） 美國(guó)ABI公司；GelDoc-It凝膠成像儀 美國(guó)UVP公司。

1.3 方法

1.3.1 大黃魚(yú)貨架期的確定

依據(jù)GB/T 18108—2008《鮮海水魚(yú)》方法取樣，對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行感官檢測(cè)，參照GB 4789.2—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定方法》進(jìn)行菌落總數(shù)的測(cè)定，參照SC/T 3032—2007《水產(chǎn)品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定方法》進(jìn)行揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVBN）含量的測(cè)定。樣品分別于5 ℃每24 h進(jìn)行檢測(cè)，于25 ℃每8 h檢測(cè)。參照SC/T 3101—2010《鮮大黃魚(yú)、凍大黃魚(yú)、鮮小黃魚(yú)、凍小黃魚(yú)》與GB 2733—2015《鮮、凍動(dòng)物性水產(chǎn)品》，當(dāng)菌落總數(shù)達(dá)到7（lg（CFU/g））或TVBN含量不小于30 mg/100 g時(shí)判斷該產(chǎn)品到達(dá)其貨架期。

1.3.2 優(yōu)勢(shì)腐敗菌的分離及鑒定

1.3.2.1 細(xì)菌的分離

在貯藏初始點(diǎn)和貨架期終點(diǎn)，在測(cè)定菌落總數(shù)的平板上根據(jù)菌落形態(tài)挑取菌株，依據(jù)菌落形態(tài)、革蘭氏染色、細(xì)胞形態(tài)、芽孢有無(wú)、運(yùn)動(dòng)性及氧化、發(fā)酵等特征，采用雙歧分類(lèi)法進(jìn)行分組，每組挑取所有菌落或若干菌落,分離純化，25 ℃培養(yǎng)48 h[14]。純化后進(jìn)行鑒定，根據(jù)貯藏初始點(diǎn)和貨架期終點(diǎn)的菌相變化確定優(yōu)勢(shì)腐敗菌。

1.3.2.2 優(yōu)勢(shì)腐敗菌的鑒定

將腐敗菌株經(jīng)過(guò)反復(fù)分離純化，接種到TSA培養(yǎng)基中25 ℃培養(yǎng)24 h。

采用MIDI脂肪酸初步鑒定：挑取分離所得菌在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上進(jìn)行劃線，25 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，挑取40 mg（濕質(zhì)量）菌落，進(jìn)行皂化、甲基化、萃取、洗滌等步驟，獲取含有細(xì)菌脂肪酸的萃取液；用氣相色譜儀結(jié)合氫火焰離子化檢測(cè)器及MIDI分析系統(tǒng)分析測(cè)試結(jié)果，分析其菌相變化，將貨架期終點(diǎn)占比最高的腐敗菌反復(fù)純化進(jìn)行下一步鑒定。

分子鑒定方法：用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取純化菌株的DNA，正向引物為27F，反向?yàn)?492R，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成：正向27F：5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向1492R：5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’。

PCR擴(kuò)增采用25.0 μL體系，反應(yīng)條件為：2.5 μL 10×PCR buffer；2.5 μL dNTP（含Mg2＋）；0.3 μL Taq DNA酶；1.0 μL正向引物；1.0 μL反向引物；1.0 μL DNA模板；16.7 μL ddH2O。PCR步驟：94 ℃熱啟動(dòng)5 min；94 ℃預(yù)變性5 min；進(jìn)行25 個(gè)循環(huán)[15-16]；94 ℃變性1 min、57 ℃退火1 min、72 ℃復(fù)性2 min；72 ℃延伸10 min。使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，產(chǎn)物約為1 500 bp。將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序。

1.3.3 優(yōu)勢(shì)腐敗菌碳源利用分析

1.3.3.1 碳源利用的測(cè)定

將鑒定后的優(yōu)勢(shì)腐敗菌劃線分離純化。取單菌落在BUY培養(yǎng)基上劃線，25 ℃培養(yǎng)48 h，挑取單菌落，接種到鑒定板配套的接種液Protrol A試劑中，使菌體均勻分散于接種液，濁度值達(dá)到（98±1）%時(shí)，將菌懸液加在96 孔鑒定板（GEN-3）內(nèi)，每孔100 μL。25 ℃培養(yǎng)100 h，5 ℃培養(yǎng)145 h，待利用達(dá)到平穩(wěn)。每3 h測(cè)定OD值，碳源包括糖類(lèi)31 種、氨基酸類(lèi)10 種、己糖磷酸類(lèi)8 種、羧酸類(lèi)15 種、酯類(lèi)3 種、其他4 種[17]。通過(guò)OD值可以反映微生物對(duì)碳源利用的種類(lèi)、速率、延滯期，體現(xiàn)微生物的生長(zhǎng)情況。

1.3.3.2 碳源利用動(dòng)力學(xué)分析

每孔顏色平均變化率（average well color development，AWCD）是衡量微生物利用不同碳源整體能力的指標(biāo)之一[18-19]，顏色變化的深淺即代表該種碳源的利用強(qiáng)弱。AWCD的計(jì)算公式如式（1）所示：

式中：Ci為每個(gè)測(cè)試孔590 nm波長(zhǎng)處的OD值；R為對(duì)照孔的OD值；n為底物數(shù)量（GEN-3板，n=71）。

參考郭全友等[20]針對(duì)環(huán)境因子對(duì)大黃魚(yú)腐敗希瓦氏菌生長(zhǎng)影響的計(jì)數(shù)法分析研究，以及Verschuere等[21]對(duì)Biolog微孔板的數(shù)據(jù)進(jìn)行建模；對(duì)4 種腐敗菌碳源利用的生長(zhǎng)情況采用Gompertz方程進(jìn)行擬合，計(jì)算其碳源利用的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，見(jiàn)式（2）：

式中：a為最小OD值；b為最大OD值與最小OD值之差；c為該碳源利用下的最大比生長(zhǎng)速率[21]；d為延滯期；x為時(shí)間；y為OD值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析：測(cè)序得到菌株16S rRNA序列（約1 500 bp），將測(cè)序結(jié)果登陸NCBI網(wǎng)站，通過(guò)BLAST程序與GenBank中的核酸序列進(jìn)行比對(duì)，從中選出相似性最高的序列，應(yīng)用Chromas version 1.62進(jìn)行多重比較，利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，選擇HKY模型，Bootstrap重復(fù)為500 次。Biolog數(shù)據(jù)分析使用SPSS 21.0軟件以及Origin 9.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大黃魚(yú)的貨架期結(jié)果

如圖1所示，貯藏初始點(diǎn)時(shí)大黃魚(yú)中的菌落總數(shù)為（4.21±0.25）（lg（CFU/g）），TVBN含量為（8.04±1.07）mg/100 g，在5 ℃貯藏過(guò)程中隨時(shí)間延長(zhǎng)，菌落總數(shù)和TVBN含量都呈逐步遞增趨勢(shì)，在50 h后上升的速率明顯增加，最終在216 h（9 d）為（7.70±0.15）（lg（CFU/g））和（29.98±2.19）mg/100 g，表明新鮮大黃魚(yú)在5 ℃時(shí)貯藏的貨架期為（9.0±1.0）d。在25 ℃貯藏過(guò)程中菌落總數(shù)和TVBN含量都隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，在24 h時(shí)分別達(dá)到（7.21±0.24）（lg（CFU/g））和（28.03±0.38）mg/100 g，超出標(biāo)準(zhǔn)，表明大黃魚(yú)在25 ℃貯藏的貨架期為（1.0±0.11）d。

圖1 貯藏過(guò)程中大黃魚(yú)的品質(zhì)變化Fig. 1 Change in microbial quality during storage of fresh P. crocea

許鐘等[22]研究了大黃魚(yú)在0、5、10 ℃冷藏條件下的貨架期，通過(guò)曲線擬合得到的貨架期分別為15、8.6 d和4.5 d；郭全友等[23]建立了0～25 ℃間新鮮大黃魚(yú)的貨架期模型，結(jié)果顯示25 ℃貯藏條件下大黃魚(yú)的貨架期為1.1 d，與本實(shí)驗(yàn)5、25 ℃時(shí)的研究結(jié)果相接近，說(shuō)明溫度對(duì)大黃魚(yú)產(chǎn)品的貨架期影響顯著。

2.2 優(yōu)勢(shì)腐敗菌鑒定

圖2 新鮮大黃魚(yú)2 種貯藏條件貨架期終點(diǎn)的菌相變化Fig. 2 Changes in bacterial flora at the end of shelf life at two storage temperatures

經(jīng)MIDI脂肪酸初步鑒定后，生鮮大黃魚(yú)貯藏初始點(diǎn)、5、25 ℃貨架期終點(diǎn)的菌相組成比例如圖2所示。由圖2可知，貯藏初期大黃魚(yú)中有不動(dòng)桿菌（Acinetobacter）24.44%、氣單胞菌（Aeromonas）11.13%、假單胞菌（Pseudomonas）20.0%、希瓦氏菌屬（Shewanella spp.）6.66%、腸桿菌（Enterobacter）6.66%、弧菌屬（Vibrio spp.）3.1%、莫氏菌屬（Mohs spp.）17.8%、未知菌屬10.33%；5 ℃貨架期終點(diǎn)時(shí)，希瓦氏菌比例從6.66%增加到65.12%，25 ℃貨架期終點(diǎn)時(shí)，弧菌相對(duì)含量從3.1%增加到48.48%。初始階段2 種菌的相對(duì)含量并不高，在貨架期終點(diǎn)達(dá)到最大比例。腐敗希瓦氏菌是冷藏大黃魚(yú)中典型的腐敗菌，適宜在低溫環(huán)境中生長(zhǎng)[24]，相對(duì)不動(dòng)桿菌屬和氣單胞菌屬在低溫貯藏環(huán)境有更短代時(shí)，生長(zhǎng)速度快；弧菌能吸附于魚(yú)體黏液，在室溫條件下更易于繁殖，在貯藏過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌具有更短的代時(shí)，生長(zhǎng)速度快，底物利用率高或者可以通過(guò)某種方式抑制其他菌屬的生長(zhǎng)[23]。其他細(xì)菌由于溫度降低、營(yíng)養(yǎng)缺乏使生長(zhǎng)速率減緩，代時(shí)增長(zhǎng)使細(xì)胞失活逐漸消亡，腐敗希瓦氏菌和河流弧菌的生長(zhǎng)繁殖逐漸占據(jù)主導(dǎo)地位，通過(guò)生長(zhǎng)代謝分解魚(yú)體蛋白質(zhì)、氨基酸及其他含氮物質(zhì)，產(chǎn)生氨、胺類(lèi)、硫化物、醇類(lèi)、醛類(lèi)、酮類(lèi)、有機(jī)酸和其他小分子產(chǎn)物，導(dǎo)致魚(yú)體腐敗變質(zhì)。

圖3 2 種特定腐敗菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 3 Phylogenetic trees for the dominant spoilage bacteria

對(duì)希瓦氏菌屬及弧菌屬的腐敗菌進(jìn)行進(jìn)一步分子鑒定，通過(guò)BLAST比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示（圖3），S1和腐敗希瓦氏菌的相似度達(dá)到100%，S2與河流弧菌的相似度達(dá)到100%，說(shuō)明在5、25 ℃條件下，新鮮大黃魚(yú)的優(yōu)勢(shì)腐敗菌分別為腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens KX822698）與河流弧菌（Vibrio fluvialis KX817289）。

李學(xué)英等[25]研究表明大黃魚(yú)低溫貯藏貨架期終點(diǎn)時(shí)的優(yōu)勢(shì)腐敗菌為腐敗希瓦氏菌，其次為假單胞菌；郭全友等[26]研究認(rèn)為大黃魚(yú)在室溫下特定腐敗菌為弧菌和腸桿菌，出現(xiàn)腸桿菌可能與水產(chǎn)品生長(zhǎng)的水質(zhì)和環(huán)境有關(guān)；Zhu Junli等[8]研究得出貯藏初期新鮮大黃魚(yú)中腐敗希瓦氏菌占29%，弧菌屬占22.6%，經(jīng)過(guò)5 d、4 ℃貯藏，腐敗希瓦氏菌比例可上升到72.1%，弧菌屬比例下降到7%；另外，朱蘇琴等[27]的研究證實(shí)河流弧菌能很好地黏附于大黃魚(yú)的黏液，室溫下黏液中的河流弧菌很容易加速大黃魚(yú)的腐敗變質(zhì)，也與本研究分離得出的新鮮大黃魚(yú)中優(yōu)勢(shì)腐敗菌為腐敗希瓦氏菌與河流弧菌結(jié)果相一致。

2.3 腐敗菌碳源利用的差異性

2.3.1 腐敗菌對(duì)總體碳源的利用

圖4 2 種腐敗菌在不同溫度下總體碳源利用情況Fig. 4 Overall carbon source utilization by the spoilage bacteria at different temperatures

由圖4可知，5 ℃條件下2 種腐敗菌的總體能源利用率低于25 ℃，5 ℃腐敗希瓦氏菌AWCD是25 ℃時(shí)的2/3，5 ℃河流弧菌的AWCD是25 ℃時(shí)的1/7；5 ℃時(shí)腐敗希瓦氏菌的AWCD大于河流弧菌，在5 ℃時(shí)河流弧菌的AWCD僅為0.13，利用能源的能力減弱，生長(zhǎng)受到抑制；25 ℃時(shí)河流弧菌的AWCD是腐敗希瓦氏菌的2.3 倍，生長(zhǎng)繁殖快。

表1 2 種腐敗菌的動(dòng)力學(xué)參數(shù)及其擬合優(yōu)度Table 1 Kinetic parameters and goodness of fit for the spoilage bacteria

通過(guò)Gompertz方程計(jì)算得出能源利用的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。由表1可知，2 種腐敗菌在5 ℃碳源條件下的最大比生長(zhǎng)速率均小于25 ℃，延滯期均大于25 ℃時(shí)。在5 ℃時(shí)腐敗希瓦氏菌較早進(jìn)入指數(shù)期增長(zhǎng)，最大比生長(zhǎng)速率是河流弧菌的4 倍；25 ℃時(shí)，腐敗希瓦氏菌的最大比生長(zhǎng)速率較大，為（0.074±0.014）h-1，河流弧菌為（0.029±0.002）h-1。證明了在25 ℃條件下，腐敗菌最大比生長(zhǎng)速率逐漸增加，延滯期縮短，促進(jìn)了腐敗菌的生長(zhǎng)，從而加速了大黃魚(yú)的腐敗。在5 ℃時(shí)腐敗希瓦氏菌能更好地利用碳源，25 ℃時(shí)河流弧菌能更好地利用碳源，碳源利用的結(jié)果與5、25 ℃分離出的優(yōu)勢(shì)腐敗菌結(jié)果相符，說(shuō)明溫度是影響碳源利用的因素，碳源利用率受限，生長(zhǎng)繁殖也受到抑制。

2.3.2 腐敗菌碳源利用的種類(lèi)分析

圖5 腐敗菌在不同溫度下總體能源利用種類(lèi)Fig. 5 Carbon source utilization profiles of the spoilage bacteria at 5 and 25 ℃

由圖5可知，在5 ℃與25 ℃時(shí)，河流弧菌都能較好地利用單糖、多糖、羧酸和氨基酸，其對(duì)單糖（27.50%、27.78%）、多糖（26.32%、24.45%）的利用率相對(duì)穩(wěn)定，25 ℃時(shí)對(duì)氨基酸的利用率下降到16.13%，對(duì)羧酸的利用率上升到14.02%，碳源利用種類(lèi)沒(méi)有發(fā)生改變；腐敗希瓦氏菌在5 ℃條件下主要利用單糖（17.22%）、多糖（22.57%）、羧酸（33.53%）和酯類(lèi)（15.67%），在25 ℃時(shí)，利用的碳源為單醣、多糖、羧酸和氨基酸，其中氨基酸的利用率相較5 ℃的4.22%上升到18.09%，酯類(lèi)的利用率明顯減少到4.19%。2 種腐敗菌各類(lèi)碳源在相同溫度下利用率差異顯著（P＜0.05）。

圖6 腐敗菌在不同溫度下各類(lèi)碳源的利用曲線Fig. 6 Carbon source utilization curves at different temperatures

由圖6可知，在5 ℃條件下，腐敗希瓦氏菌在各碳源條件下的最大比生長(zhǎng)速率從大到小為多糖（0.31 h-1）、酯類(lèi)（0.19 h-1）、羧酸（0.16 h-1）、單糖（0.12 h-1）和氨基酸（0.079 h-1）；河流弧菌各種碳源條件下的最大比生長(zhǎng)速率從大到小為多糖（0.027 h-1）、單糖（0.024 h-1）、氨基酸（0.022 h-1）和羧酸（0.019 h-1）；腐敗希瓦氏菌各類(lèi)碳源下的最大比生長(zhǎng)速率均高于河流弧菌，說(shuō)明河流弧菌的各類(lèi)碳源利用在5 ℃受到抑制。25 ℃時(shí)腐敗希瓦氏菌在單糖、多糖、氨基酸和羧酸下的最大比生長(zhǎng)速率均大于河流弧菌，其中在羧酸下的最大比生長(zhǎng)速率最大（1.24 h-1），腐敗希瓦氏菌利用碳源的速率大于河流弧菌，但對(duì)各類(lèi)能源的利用量少于河流弧菌。

郭全友等[11]對(duì)輕腌青魚(yú)貨架期終點(diǎn)葡萄球菌的碳源利用情況進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示該種腐敗菌主要利用單糖、多糖、氨基酸及羧酸，與本研究中河流弧菌利用的碳源種類(lèi)相似，與腐敗希瓦氏菌的主要利用能源不同，表明不同腐敗菌的碳源利用種類(lèi)存在差異，同種腐敗菌不同溫度下的利用種類(lèi)、比生長(zhǎng)速率、延滯期都存在差異。

2.3.3 腐敗菌對(duì)各類(lèi)碳源利用的差異性

2.3.3.1 多糖利用

圖7 腐敗菌在不同溫度下對(duì)多糖利用的曲線Fig. 7 Polysaccharide utilization curves of the dominant spoilage bacteria at different temperatures

從圖7可知，在5 ℃條件下，2 種腐敗菌都能利用肌苷和D-海藻糖；其中，腐敗希瓦氏菌能利用蔗糖、糊精和D-乳糖，河流弧菌還能利用D-麥芽糖、水蘇糖、蜜二糖和蜜三糖。在25 ℃條件下，2 種腐敗菌都能利用蔗糖、D-海藻糖、D-麥芽糖；其中，腐敗希瓦氏菌還能利用D-乳糖、水蘇糖和肌醇；河流弧菌還能利用糊精、D-松二糖。D-海藻糖是2 種腐敗菌都能利用的多糖，有研究表明[28]海藻糖能夠提高酵母菌的抗凍性，高濃度的海藻糖能夠使酵母菌在低溫時(shí)仍然保持活性，同樣低溫時(shí)D-海藻糖也可以給腐敗菌提供部分能量。

通過(guò)Gompertz模型擬合圖7曲線，得到的動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較顯示，5 ℃條件下，腐敗希瓦氏菌在糊精中的最大比生長(zhǎng)速率最大（（0.087±0.016）h-1）且利用量最大，在肌苷中的延滯期最短（（13.778±0.649）h）；河流弧菌在蔗糖中的最大比生長(zhǎng)速率最大（（0.024±0.010）h-1）且延滯期最短（（20.8±1.85）h）。說(shuō)明糊精和蔗糖分別為2 種腐敗菌在5 ℃條件下最容易利用的多糖。在25 ℃條件下，腐敗希瓦氏菌在肌醇中的最大比生長(zhǎng)速率最大（（0.1698±0.031）h-1），且利用量最大，對(duì)蔗糖利用延滯期最短（（3.63±0.61）h）；河流弧菌在水蘇糖中的最大比生長(zhǎng)速率最大（（0.059±0.006）h-1），在D-麥芽糖中的延滯期最短（（0.024±0.001）h）。說(shuō)明肌醇和水蘇糖是2 種腐敗菌在25 ℃條件下最容易利用的多糖。同種腐敗菌不同溫度下對(duì)多糖利用的種類(lèi)大致相同，室溫時(shí)能利用的種類(lèi)更多，最大比生長(zhǎng)速率更大；不同腐敗菌相同溫度下能利用的多糖種類(lèi)有所不同，2 種溫度條件下腐敗希瓦氏菌多糖利用的速率均大于河流弧菌。

2.3.3.2 單糖利用

圖8 腐敗菌在不同溫度下對(duì)單糖利用生長(zhǎng)曲線Fig. 8 Monosaccharide utilization curves of the dominant spoilage bacteria at different temperatures

由圖8可知，在5、25 ℃條件條件下，腐敗希瓦氏菌都能利用D-阿拉伯醇、β-甲酰-D-葡糖苷、D-水楊苷、N-乙酰-β-D-甘露糖胺、N-乙酰-D-半乳糖胺、D-果糖；5 ℃條件下還能利用α-D-葡萄糖。

在5 ℃條件下，河流弧菌能利用的單糖有：N-乙酰-D-葡糖胺、N-乙酰-D-半乳糖胺、L-果糖，在25 ℃條件下，還能利用D-水楊苷、α-D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、D-甘露醇。2 種腐敗菌能共同利用的多糖為D-果糖、N-乙酰-D-半乳糖胺。

擬合得到圖8曲線，動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較顯示，在5 ℃條件下,腐敗希瓦氏菌在D-水楊苷中的最大比生長(zhǎng)速率最大（（0.37±0.000 3）h-1），在N-乙酰-β-D-甘露糖胺中的延滯期最短（（17.319±3.141）h）；河流弧菌在N-乙酰-D-葡糖胺中的最大比生長(zhǎng)速率最大（（0.010 4±0.001 1）h-1）且延滯期最短（（22.538±4.03）h）。說(shuō)明腐敗希瓦氏菌生長(zhǎng)初期受N-乙酰-β-D-甘露糖胺作用，生長(zhǎng)過(guò)程中D-水楊苷更容易被利用，而N-乙酰-D-葡糖胺則是河流弧菌生長(zhǎng)繁殖中最容易利用的單糖。

在25 ℃條件下，腐敗希瓦氏菌在D-阿拉伯醇中的最大比生長(zhǎng)速率最大（（0.180±0.063）h-1），在D-果糖中的延滯期最?。ǎ?.98±0.892）h）；河流弧菌在N-乙酰-D-葡糖胺中的最大比生長(zhǎng)速率最大（（0.064±0.005）h-1）且延滯期最短（（5.46±1.13）h）。說(shuō)明腐敗希瓦氏菌生長(zhǎng)初期最先利用D-果糖，生長(zhǎng)過(guò)程中D-阿拉伯醇更易被利用。

腐敗希瓦氏菌在5 ℃條件下單糖利用的種類(lèi)與25 ℃大致相同，但利用效率較25 ℃低；河流弧菌在5 ℃條件下單糖的利用種類(lèi)少于25 ℃，5 ℃時(shí)能利用的單糖在25 ℃時(shí)的利用效率占前幾位。腐敗希瓦氏菌在2 種溫度條件下利用速率最大、延滯期最短的單糖均不相同。

2.3.3.3 腐敗菌對(duì)氨基酸的利用

圖9 腐敗菌在不同溫度下對(duì)氨基酸利用生長(zhǎng)曲線Fig. 9 Amino acid utilization curves of the spoilage bacteria at different temperatures

圖10 腐敗菌在不同溫度下對(duì)羧酸利用生長(zhǎng)曲線Fig. 10 Carboxylic acid utilization curves of the spoilage bacteria at different temperatures

由圖9可知，在5 ℃條件下，腐敗希瓦氏菌能夠利用L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-絲氨酸、L-焦谷氨酸；在25 ℃條件下，還能利用D-絲氨酸、L-脯氨酸；在低溫環(huán)境中，腐敗希瓦氏菌氨基酸的利用效率比25 ℃時(shí)顯著下降。在5 ℃條件下，河流弧菌能利用的氨基酸為L(zhǎng)-脯氨酸、D-絲氨酸和L-組胺；在25 ℃條件下，還能利用L-丙氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸。

擬合得到圖9曲線，動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較顯示，在5 ℃條件下，腐敗希瓦氏菌在L-絲氨酸中最大比生長(zhǎng)速率最大（（0.013 6±0.005 0）h-1），在L-焦谷氨酸中延滯期最短（（20.96±1.601）h）；河流弧菌在L-脯氨酸中的最大比生長(zhǎng)速率最大（（0.004 6±0.001）h-1），且延滯期最短（（25.20±2.14）h）。說(shuō)明腐敗希瓦氏菌生長(zhǎng)初期先利用L-焦谷氨酸，L-絲氨酸在生長(zhǎng)過(guò)程中更容易被利用。L-脯氨酸為5 ℃條件下河流弧菌最容易利用的氨基酸。

在25 ℃條件下，腐敗希瓦氏菌在L-脯氨酸中最大比生長(zhǎng)速率最大（（0.117 2±0.064）h-1），在L-焦谷氨酸中延滯期最短（（0.67±0.006）h）；河流弧菌在D-絲氨酸中最大比生長(zhǎng)速率最大（（0.049±0.005）h-1），在L-谷氨酸中延滯期最短（（5.39±2.03）h）。2 種溫度下，腐敗希瓦氏菌對(duì)L-焦谷氨酸的延滯期均最短，說(shuō)明L-焦谷氨酸在腐敗希瓦氏菌生長(zhǎng)繁殖初期為主要氨基酸供給。

2 種腐敗菌都能利用絲氨酸，研究顯示絲氨酸在使細(xì)菌適應(yīng)厭氧環(huán)境時(shí)起重要作用[29]。據(jù)研究表明[30]養(yǎng)殖大黃魚(yú)肌肉中的氨基酸含量較多的為谷氨酸（9.67 mg/100 mg）、天冬氨酸（5.68 mg/100 mg）、賴(lài)氨酸（4.76 mg/100 mg），由此可知并非氨基酸含量越高，腐敗菌就利用的越多，腐敗菌對(duì)于氨基酸的利用，還受到其自身性質(zhì)的影響。

2.3.3.4 腐敗菌對(duì)羧酸的利用

由圖10可知，在5 ℃條件下，腐敗希瓦氏菌能夠利用L-蘋(píng)果酸、D-蘋(píng)果酸、溴-丁二酸和乙酰乙酸；在25 ℃條件下，腐敗希瓦氏菌能夠利用L-蘋(píng)果酸、D-蘋(píng)果酸、溴-丁二酸、乙酰乙酸和乙酸。在5 ℃條件下，河流弧菌能夠利用L-乳酸、檸檬酸、L-蘋(píng)果酸和甲酸；在25 ℃條件下，河流弧菌能夠利用L-乳酸、檸檬酸、L-蘋(píng)果酸。在2 種溫度條件下，2 種腐敗菌都能利用的羧酸為L(zhǎng)-蘋(píng)果酸。

通過(guò)Gompertz模型擬合圖10曲線，得到的動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較顯示，在5 ℃條件下，腐敗希瓦氏菌在L-蘋(píng)果酸中最大比生長(zhǎng)速率最大（（0.090±0.006）h-1），在乙酸中延滯期最短（（18.10±1.360）h）；河流弧菌在甲酸中最大比生長(zhǎng)速率最大（（0.012±0.001）h-1），在L-乳酸中延滯期最短（（13.23±3.31）h）。說(shuō)明在5 ℃時(shí)腐敗希瓦氏菌的生長(zhǎng)初期先利用乙酸，之后L-蘋(píng)果酸最容易被利用；河流弧菌的生長(zhǎng)先利用L-乳酸，在生長(zhǎng)過(guò)程中甲酸更容易被利用。

在25 ℃條件下，腐敗希瓦氏菌在L-蘋(píng)果酸中的最大比生長(zhǎng)速率最大（（0.140±0.02）h-1）且延滯期最短（（3.801±0.735）h）；河流弧菌在檸檬酸中的最大比生長(zhǎng)速率最大（（0.073±0.006）h-1），且延滯期最短（（7.42±0.78）h）。說(shuō)明25 ℃時(shí)L-蘋(píng)果酸和檸檬酸分別為2 種腐敗菌最容易利用的羧酸。

2.3.3.5 腐敗菌對(duì)酯類(lèi)的利用

圖11 腐敗菌在不同溫度下對(duì)酯類(lèi)利用生長(zhǎng)曲線Fig. 11 Ester utilization curves of the spoilage bacteria at different temperatures

由圖11可知，在5 ℃條件下，腐敗希瓦氏菌能較好地利用丙酮酸甲酯、D-乳酸甲酯和吐溫40，最大比生長(zhǎng)速率分別為（0.088±0.001 2）、（0.089±0.002 3）h-1和（0.043±0.002 2）h-1，說(shuō)明D-乳酸甲酯為腐敗希瓦氏菌生長(zhǎng)過(guò)程中最容易被利用的酯類(lèi)。而河流弧菌對(duì)酯類(lèi)的利用很低，酯類(lèi)并非河流弧菌生長(zhǎng)主要利用的碳源。曾有學(xué)者[31-32]利用月桂酸單甘油酯微乳液制成復(fù)合保鮮劑；利用油酸乙酯、吐溫80、戊醇制備O/W型微乳液抑制腐敗菌的生長(zhǎng)。為此，可通過(guò)腐敗菌對(duì)酯類(lèi)的利用情況，為進(jìn)一步研究O/W型復(fù)合保鮮劑提供了科學(xué)依據(jù)。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究了新鮮大黃魚(yú)在不同溫度下，其優(yōu)勢(shì)腐敗菌對(duì)碳源利用、動(dòng)力學(xué)的差異性，得到結(jié)論為：溫度影響了大黃魚(yú)的貨架期，5 ℃時(shí)貨架期為（9.0±1.0）d，25 ℃時(shí)貨架期為（1.0±0.11）d。

5 ℃貨架期終點(diǎn)時(shí)的優(yōu)勢(shì)腐敗菌為腐敗希瓦氏菌，25 ℃時(shí)貨架期終點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)腐敗菌為河流弧菌。

腐敗希瓦氏菌在5 ℃時(shí)能更好地利用碳源，河流弧菌在25 ℃時(shí)能更好地利用碳源，碳源利用的結(jié)果與5、25 ℃分離出的優(yōu)勢(shì)腐敗菌結(jié)果相符。低溫使碳源利用率受限，生長(zhǎng)繁殖受到抑制。

5 ℃時(shí)腐敗希瓦氏菌主要利用的碳源種類(lèi)為單醣、多糖、羧酸和酯類(lèi)，河流弧菌為單醣、多糖、羧酸和氨基酸。25 ℃時(shí)腐敗希瓦氏菌和河流弧菌都主要利用單糖、多糖、羧酸和氨基酸。5 ℃條件下糊精和蔗糖分別為腐敗希瓦氏菌和河流弧菌最容易利用的多糖；25 ℃時(shí)肌醇和水蘇糖是腐敗希瓦氏菌和河流弧菌最容易利用的多糖。2 種腐敗菌能夠共同利用的單糖為D-果糖、N-乙酰-D-半乳糖胺。5 ℃時(shí)腐敗希瓦氏菌對(duì)氨基酸的利用率明顯下降，25 ℃時(shí)2 種腐敗菌能夠共同利用的氨基酸為L(zhǎng)-脯氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸和D-絲氨酸。5、25 ℃時(shí)2 種腐敗菌能共同利用的羧酸種類(lèi)較少，為L(zhǎng)-蘋(píng)果酸。在5 ℃條件下，腐敗希瓦氏菌能較好地利用丙酮酸甲酯、D-乳酸甲酯和吐溫40。

本研究通過(guò)2 種溫度環(huán)境條件下，腐敗希瓦氏菌、河流弧菌對(duì)碳源利用的差異性分析，研究了2 種腐敗菌的生長(zhǎng)、底物利用及其動(dòng)力學(xué)模型，以期在今后可以通過(guò)調(diào)節(jié)共同利用的底物碳源因子，或通過(guò)研制復(fù)合保鮮劑抑制腐敗菌的生長(zhǎng)，適當(dāng)延長(zhǎng)大黃魚(yú)產(chǎn)品的貨架期。