林妍，潘鵬宇，鄧錦芳，王淳

(1.沈陽(yáng)中心血站；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110000；3.荊州市中心醫(yī)院，湖北 荊州 434020)

近年來(lái)，隨著惡性腫瘤發(fā)病率的增加及腫瘤治療過(guò)程中化療藥物的廣泛使用，化療藥物所引起的女性卵巢功能損傷，甚至發(fā)育障礙或卵巢功能早衰等逐漸受到社會(huì)的關(guān)注。化療藥物導(dǎo)致的卵巢功能損傷主要表現(xiàn)為閉經(jīng)、不孕、性功能障礙、骨質(zhì)疏松等，給患者本人及家庭帶來(lái)巨大痛苦，并對(duì)其社會(huì)心理和性心理產(chǎn)生不良影響[1-2]。

化療藥物對(duì)卵巢損傷主要表現(xiàn)在對(duì)原始卵泡的干預(yù)，如干預(yù)卵母細(xì)胞和前顆粒細(xì)胞，干擾卵泡的成熟、耗盡原始卵泡及誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞凋亡等[3]。因此保護(hù)卵巢免受化療藥物損傷的藥物也主要針對(duì)于保護(hù)卵泡，如垂體促性腺激素可抑制卵巢細(xì)胞上的促性腺激素釋放激素受體，通過(guò)阻斷卵泡的成熟來(lái)保護(hù)卵泡不被破壞。此外，雌激素一方面通過(guò)負(fù)反饋抑制下丘腦-垂體-卵巢軸，使卵巢進(jìn)入暫時(shí)抑制狀態(tài)，從而降低卵泡對(duì)化療藥物的敏感性；另一方面，雌激素還可通過(guò)與胞內(nèi)受體結(jié)合，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)而抑制化療藥物誘導(dǎo)的卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，從而在一定程度上保護(hù)卵巢的儲(chǔ)備功能[4]。

化療藥物誘導(dǎo)的卵巢功能損傷與中醫(yī)所述“閉經(jīng)”、“血枯”、“血隔”、“月經(jīng)過(guò)少”、“經(jīng)水早斷”等證相似。整理中醫(yī)治療上述病證的方藥，多為補(bǔ)虛之藥，如當(dāng)歸、熟地、莬絲子、仙靈脾、甘草、肉蓯蓉等[5]。其中，肉蓯蓉具有補(bǔ)腎陽(yáng)、益精血之功效；《神農(nóng)本草經(jīng)》中所載肉蓯蓉主治婦人癥瘕之證，《藥性論》中記載肉蓯蓉可治女人血崩之證，《本草綱目》記載肉蓯蓉可強(qiáng)陰、益精氣、多子[6]。前期研究發(fā)現(xiàn)，中藥肉蓯蓉具有保護(hù)順鉑損傷小鼠卵巢的功能[7]；那么作為肉蓯蓉的主要活性成分——松果菊苷(echinacoside，ECH)是否也具有保護(hù)化療藥物誘導(dǎo)的卵巢功能損傷的作用？本實(shí)驗(yàn)以順鉑誘導(dǎo)的小鼠卵巢損傷為模型，觀(guān)察ECH是否具有保護(hù)卵巢功能的作用，并探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑

松果菊苷(南京光潤(rùn)生物制品有限公司)、順鉑凍干粉DDP(齊魯制藥有限公司)、鼠雌二醇(Estradiol，E2)、卵泡雌激素(Follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)酶聯(lián)免疫試劑盒(上海尚樂(lè)生物科技有限公司)、超微量ATP酶測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 動(dòng)物藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)

雌性昆明小鼠，40只，體重(20±2)g，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。小鼠隨機(jī)分成5組(8只/組)，對(duì)照組、順鉑組、順鉑+低濃度ECH組、順鉑+中濃度ECH組及順鉑+高濃度ECH組。順鉑組、順鉑+低濃度ECH組、順鉑+中濃度ECH組及順鉑+高濃度ECH組小鼠，分別給予腹腔注射順鉑，前3天：3.0 mg/(kg·d)；后4天：2.0 mg/(kg·d)[8]，共7 d；同時(shí)灌胃給予等體積去離子水及不同濃度的ECH溶液10 mg/(kg·d)、20 mg/(kg·d)及40 mg/(kg·d)，共14 d 。對(duì)照組小鼠給予同等劑量的生理鹽水腹腔注射及去離子水灌胃處理。在實(shí)驗(yàn)的第1、7、14天，分別測(cè)量各組小鼠體重。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，水合氯醛麻醉小鼠，心臟取血，室溫靜止2 h后離心，吸取上層血清，-80 ℃保存?zhèn)溆?；同時(shí)取卵巢組織稱(chēng)重，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 ELISA方法檢測(cè)外周血E2、FSH濃度

取-80 ℃保存的各組小鼠血清，置于冰上溶解。按照說(shuō)明書(shū)于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。

1.4 ATP酶活性的檢測(cè)

取各組小鼠卵巢組織，置于冰上溶解，研磨法制備組織勻漿。按照說(shuō)明書(shū)，利用化學(xué)比色法，于636 nm波長(zhǎng)，測(cè)定卵巢組織中無(wú)機(jī)磷的含量來(lái)計(jì)算出樣品中的ATP酶活性(Na+-K+-ATPase及Ca2+-Mg2+-ATPase)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 ECH具有保護(hù)順鉑損傷小鼠卵巢組織的作用

對(duì)小鼠體重分析，可見(jiàn)：實(shí)驗(yàn)開(kāi)始的第1天，各組小鼠體重并無(wú)差異；但第7、14天，順鉑組小鼠體重明顯低于正常組；順鉑+不同濃度ECH干預(yù)組小鼠體重明顯高于順鉑組，尤以順鉑+中濃度ECH組明顯，但順鉑+高濃度ECH組小鼠體重略有下降(圖1)。

從大體上觀(guān)察，正常組卵巢表面飽滿(mǎn)、平滑；順鉑組卵巢較正常組小，表面有凹陷且不光滑；順鉑+不同濃度ECH干預(yù)組卵巢外觀(guān)逐漸接近正常組小鼠卵巢。順鉑組小鼠卵巢重量明顯低于正常組；順鉑+不同濃度ECH干預(yù)組小鼠卵巢重量明顯高于順鉑組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

2.2 ECH具有改善卵巢E2、FSH分泌的作用

各組E2水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖3A)。順鉑組小鼠FSH水平明顯高于對(duì)照組，中、高濃度ECH干預(yù)可明顯降低順鉑誘導(dǎo)的FSH水平升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3B)。

2.3 ECH對(duì)卵巢組織Na+-K+-ATPase及Ca2+-Mg2+-ATPase活性的影響

與對(duì)照組相比，順鉑組小鼠Na+-K+-ATPase及Ca2+-Mg2+-ATPase活性明顯低于對(duì)照組；不同濃度ECH干預(yù)可明顯升高Na+-K+-ATPase及Ca2+-Mg2+-ATPase活性(表1)。

表1 ECH對(duì)卵巢組織Na+-K+-ATPase及Ca2+-Mg2+-ATPase活性的影響

注：*順鉑組與對(duì)照組相比，P<0.05；**順鉑組與對(duì)照組相比，P<0.01；▲順鉑+不同濃度ECH組與順鉑組相比，P<0.05；▲▲順鉑+不同濃度ECH組與順鉑組相比，P<0.01

3 討 論

ROS可導(dǎo)致線(xiàn)粒體內(nèi)膜上的心磷脂過(guò)氧化，致使結(jié)合在心磷脂上的細(xì)胞色素C從線(xiàn)粒體內(nèi)膜解離釋放至胞漿，釋放的細(xì)胞色素C與凋亡蛋白激活因子1(Apaf-1)和凋亡相關(guān)蛋白——Caspase-9前體結(jié)合，激活Caspase級(jí)聯(lián)的凋亡途徑，從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生線(xiàn)粒體凋亡[11]。同樣，ROS還可引起線(xiàn)粒體DNA(mtDNA)氧化應(yīng)激，使線(xiàn)粒體基因組編碼的部分蛋白表達(dá)發(fā)生改變，導(dǎo)致線(xiàn)粒體呼吸鏈的中斷、膜電位的崩潰和ATP合成障礙，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)研究表明，化療藥順鉑可破壞小鼠卵巢功能，造成卵泡數(shù)量減少和黃體功能喪失[3]3301，主要與化療藥物使小鼠體內(nèi)自由基產(chǎn)生增多，最終導(dǎo)致包括卵巢在內(nèi)的臟器功能損傷有關(guān)[12]。

我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，肉蓯蓉水提物可明顯緩解化療藥順鉑對(duì)小鼠卵巢的損傷，包括增加卵巢重量、改善血清FSH及E2水平，且肉蓯蓉的這種保護(hù)作用與其上調(diào)卵巢線(xiàn)粒體融合蛋白(Mitofusin-2)、升高順鉑引起的線(xiàn)粒體膜電位降低及透性增加，減少順鉑誘導(dǎo)的卵巢顆粒細(xì)胞凋亡有關(guān)[7]90-101。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討肉蓯蓉主要活性成分——ECH保護(hù)卵巢的功能。本研究發(fā)現(xiàn)，ECH同樣具有增加順鉑損傷小鼠卵巢質(zhì)量、改善卵巢FSH及E2分泌水平的作用，且ECH保護(hù)卵巢的作用與其改善順鉑引起的線(xiàn)粒體功能損傷有關(guān)。

本研究初步探明ECH具有保護(hù)化療藥物誘導(dǎo)的小鼠卵巢功能損傷的作用，但ECH保護(hù)卵巢功能的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

(此文圖1-3見(jiàn)附頁(yè)2-3)

文見(jiàn)第5-8頁(yè)

注*與順鉑組第7天相比，P<0.05；**與順鉑組第7天相比，P<0.01；▲與順鉑組第14天相比，P<0.05；▲▲與順鉑組第14天相比，P<0.01
圖1 小鼠體重變化情況

圖2 小鼠卵巢變化情況

A：血清FSH水平；B：血清FSH水平
圖3 血清E2、FSH水平圖