潘清華 刑永新

(興安職業(yè)技術(shù)學(xué)院五官科，內(nèi)蒙古 烏蘭浩特 137400)

口腔癌是頭頸部常見的惡性腫瘤之一，其中口腔鱗癌占90%以上，因其生長(zhǎng)快、浸潤(rùn)性強(qiáng)、轉(zhuǎn)移率高，是患者死亡的主要原因〔1，2〕。小柴胡湯能提高機(jī)體免疫力及有明顯的抑瘤作用，其抗腫瘤作用在S180、Lewis、C6等荷瘤鼠中已有廣泛研究〔3～5〕。紫杉醇是美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)的抗癌癥臨床藥物，通過(guò)促進(jìn)微管聚合抑制微管解聚形成穩(wěn)定的微管聚合物，進(jìn)而抑制增殖細(xì)胞的有絲分裂、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡〔1，6～9〕。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立人口腔鱗癌細(xì)胞CAL27荷瘤小鼠模型，檢測(cè)血清及腫瘤組織中B細(xì)胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)蛋白含量及蛋白陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度，進(jìn)一步探討小柴胡湯的抑瘤機(jī)制和聯(lián)合用藥的增強(qiáng)劑作用。

1 材料與方法

1.1材料 小柴胡湯組成〔3〕：柴胡(78.125 g)；黃芩(46.875 g)；人參(46.875 g)；清半夏(42.000 g)；炙甘草(46.875 g)；生姜(46.875 g)；大棗(30.000 g)。紫杉醇由Sigma公司提供；人口腔鱗癌細(xì)胞CAL27購(gòu)于長(zhǎng)春鼎國(guó)生物有限公司；Bcl-2、 Bax酶聯(lián)免疫吸附試劑盒均由南京建成生物有限公司提供；兔抗Bcl-2、 Bax購(gòu)于北京博奧森生物有限公司；SP9710試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購(gòu)于福州邁新生物有限公司。

1.2模型制備與實(shí)驗(yàn)分組 取培養(yǎng)的人口腔鱗癌CAL27細(xì)胞，制成2×106/20 μl的CAL27細(xì)胞懸液，接種于雄性9周齡BALB/c裸鼠、右前肢腋窩皮下，體重(26.8±1.2)g，待腫瘤長(zhǎng)至0.5 cm×0.5 cm時(shí)，隨機(jī)分為腫瘤對(duì)照組(灌胃給予生理鹽水+腹腔注射生理鹽水)、小柴胡湯組(灌胃給予小柴胡湯+腹腔注射生理鹽水)、紫杉醇組(灌胃給予生理鹽水+腹腔注射紫杉醇)、聯(lián)合用藥組(灌胃給予小柴胡湯+腹腔注射紫杉醇)各12只。

1.3中藥制備〔3〕小柴胡湯中7味中藥以8倍量蒸餾水浸泡30 min，加熱保持微沸30 min，過(guò)濾；殘?jiān)?倍量蒸餾水，微沸30 min，過(guò)濾；合并2次濾液，混合后濾液干燥濃縮至100 ml，即小柴胡湯E(10 g/ml)；以類似方法濃縮熬制小柴胡湯D(20 g/ml)；小柴胡湯C(50 g/ml)；4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4給藥方法及取材 每組灌胃及腹腔注射量均為0.1 ml，小柴胡湯組50 g/kg、紫杉醇30 mg/kg連續(xù)隔天給藥7次，于最后一次給藥后第2天處死小鼠，眼球取血(3 000 r/min離心10 min)及腫瘤組織(部分-20℃凍存待測(cè)，部分固定于4%多聚甲醛液中)。

1.5荷瘤小鼠血清及腫瘤組織中Bcl-2、Bax蛋白含量檢測(cè) 使用儀器Epoch酶標(biāo)儀(美國(guó))，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)荷瘤小鼠血清及腫瘤組織中Bcl-2、Bax蛋白含量，嚴(yán)格按照試劑盒方法操作。

1.6荷瘤小鼠腫瘤組織中Bcl-2、 Bax蛋白陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度檢測(cè) 腫瘤組織4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、包埋、切片兩張，厚度3 μm，80℃烤箱烘烤6 h采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)。采用Motic Images Advanced 3.2圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)光密度(OD)值，OD值越大陽(yáng)性表達(dá)越高。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

與腫瘤對(duì)照組比較，小柴胡湯、紫杉醇、聯(lián)合用藥組血清及腫瘤組織Bcl-2蛋白含量及蛋白陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度明顯降低，且依次降低趨勢(shì)明顯，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Bax蛋白含量及蛋白陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度明顯升高，且依次升高趨勢(shì)明顯，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1，圖1。

表1 各組血清、腫瘤組織中Bcl-2、 Bax蛋白含量及蛋白陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度比較

與腫瘤對(duì)照組比較：1)P<0.05；與小柴胡湯組比較：2)P<0.05；與紫杉醇組比較：3)P<0.05

圖1 各組Bcl-2、Bax表達(dá)(×200，免疫組化SP染色)

3 討 論

口腔鱗狀細(xì)胞癌是額面部最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率及發(fā)病年輕化趨勢(shì)日益升高〔1，2〕。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控及凋亡調(diào)控相關(guān)基因與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、預(yù)后密切相關(guān)〔2〕。

Bcl基因是目前最受重視的調(diào)控細(xì)胞凋亡的基因家族，Bcl-2、Bax是其中兩個(gè)重要成員，二者具有同源性，但生物學(xué)作用相互拮抗〔10～12〕。Bcl-2是一種抑制凋亡基因也是存活基因，能通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡而延長(zhǎng)細(xì)胞壽命〔13，14〕。Bax是一種促凋亡基因，可對(duì)抗Bcl-2活性，能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡而減少細(xì)胞壽命〔12，15〕。Bcl-2在腫瘤組織中的高表達(dá)和Bax在腫瘤組織中的低表達(dá)，均可促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，二者與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

本研究結(jié)果說(shuō)明小柴胡湯、紫杉醇均能夠通過(guò)下調(diào)Bcl-2、上調(diào)Bax表達(dá)水平，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)，二者聯(lián)合用藥作用更為顯著，因此小柴胡湯除自身的抗腫瘤作用得到驗(yàn)證，聯(lián)合紫杉醇用藥還能起到增強(qiáng)劑的作用，更好地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡通路，從而發(fā)揮其腫瘤治療增強(qiáng)劑的作用，為小柴胡湯聯(lián)合用藥的推廣應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。