仇志富 吳曉光

(承德醫(yī)學院中藥研究所，河北 承德 067000)

胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信號轉(zhuǎn)導通路是腦出血損傷所出現(xiàn)的細胞凋亡活動中很有影響力的信號通路，可以通過對凋亡蛋白或基因進行抑制而發(fā)揮效果〔1〕。補陽還五湯是臨床上用于治療缺血性、出血性腦病的常用藥物之一，其能通過減少神經(jīng)元死亡、促進神經(jīng)修復再生等機制來發(fā)揮防治作用〔2〕。腦出血研究中補陽還五湯能夠激活數(shù)條與細胞凋亡聯(lián)系密切的信號轉(zhuǎn)導通路，然而其對PI3K/AKT信號通路的研究一直無人問津。本實驗以經(jīng)典方法復制腦出血大鼠模型，給藥干預一定時間后檢測腦組織PI3K/AKT信號通路的兩大組成蛋白——PI3K、AKT蛋白表達變化，檢測凋亡密切相關(guān)蛋白——Bcl-2、BAX的表達變化和腦水腫、腦組織細胞凋亡變化，研究補陽還五湯對腦出血的作用效果及深層作用機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物及主要的試劑 實驗動物為成年雄性清潔級SD大鼠，數(shù)量為72只，體質(zhì)量(250±20)g。補陽還五湯的藥物組成及用量：生黃芪(120 g)、赤芍(4.5 g)、當歸尾(6 g)、川芎(4.5 g)、桃仁(3 g)、干地龍(3 g)、紅花(3 g)，購自承德大藥房，銀杏葉片成品由雙鶴藥業(yè)有限公司所提供。AKT、PI3K免疫組化試劑盒，購自上海雅吉生物科技有限公司；兔抗人Bcl-2、BAX多抗，購自上海延生實業(yè)有限公司；TUNEL凋亡檢測試劑盒，購自北京天恩澤基因科技有限公司，其他試劑皆為國產(chǎn)分析純。

1.2動物分組和處理 實驗用SD大鼠隨機分成4組：假手術(shù)組(18只)、模型組(18只)、補陽還五湯組(18只)、銀杏葉片組(18只)。補陽還五湯組、銀杏葉片組灌胃給藥，藥量分別為26 g·kg-1·d-1和3.5 mg·kg-1·d-1(均按人和大鼠間體表面積折算的2倍劑量給藥)，假手術(shù)組及模型組給予生理鹽水。

1.3分別作如下處理 補陽還五湯組、銀杏葉片組、模型組大鼠模型的制備采用文獻方法〔3〕：以10%水合氯醛(400 mg/kg，腹腔注射)麻醉大鼠后，于立體儀上固定，于頭部正中行縱行切口，將大鼠骨膜剝離，使其冠狀縫和前囟裸露。在前囟之前約2.0 mm、中線右側(cè)約3.0 mm處鉆一約1.0 mm直徑的小孔。以微量注射器從股動脈抽取適量的血液，借助立體定向儀沿鉆孔垂直進針6.0 mm左右，緩緩注血80 μl，留針10 min后撤針，以消毒針縫合切口。假手術(shù)組僅僅裸露頸總動脈、神經(jīng)。在造模后第28天起，補陽還五湯組、銀杏葉片組均以灌胃給藥方式連續(xù)給藥5 w；其余組別給予適宜的生理鹽水。

1.4PI3K、AKT蛋白表達檢測 Leica石蠟切片機連續(xù)冠狀切片，片厚5 μm，4℃冰箱保存，用于凋亡蛋白與基因的免疫組化測試，其中PI3K一抗的稀釋度為1∶150、AKT一抗的稀釋度為1∶100。嚴格按照試劑盒要求進行操作，高背景下觀察陽性細胞表達變化。

1.5凋亡調(diào)控蛋白的檢測 免疫組化SABC法進行凋亡調(diào)控蛋白的檢測，高倍鏡下進行觀察，凋亡調(diào)控蛋白的陽性表達呈現(xiàn)棕黃色。

1.6腦組織含水量檢測 腦組織含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.7細胞凋亡數(shù)量檢測 TUNEL法檢測細胞凋亡變化，嚴格按照TUNEL凋亡檢測試劑盒操作說明進行。

1.8血腦屏障(BBB)通透性檢測 伊文恩藍(EB)法檢測大鼠腦組織血腦屏障通透性。

1.9統(tǒng)計學處理 以SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析法、LSD及Games-Howell法檢驗。

2 結(jié) 果

2.1PI3K/AKT信號通路的影響 信號通路的兩大蛋白皆位于胞質(zhì)之上，其陽性細胞的表達呈現(xiàn)棕黃色。同假手術(shù)組進行比較，模型組PI3K、AKT顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，補陽還五湯組與銀杏葉片組PI3K、AKT顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1，圖1，圖2。

2.2腦組織含水量的變化 模型組大鼠腦組織含水

量顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)；補陽還五湯組、銀杏葉片組大鼠腦組織含水量顯著低于模型組(P<0.05)。 見表2。

2.3腦組織中EB含量的變化 通過EB含量變化來反映BBB通透性變化，EB含量升高，BBB通透性增強；反之，BBB通透性降低。模型組大鼠EB含量明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)。補陽還五湯組、銀杏葉片組大鼠腦組織EB含量明顯低于模型組(P<0.05)。 見表2。

2.4Bcl-2、BAX蛋白表達變化 神經(jīng)元胞質(zhì)呈棕黃色結(jié)果即為Bcl-2、BAX蛋白的陽性表達。在假手術(shù)組中Bcl-2和BAX通常也會有少量的表達，但是其Bcl-2/BAX的比值卻始終接近于1，與模型組比較，補陽還五湯組和銀杏葉片組Bcl-2/BAX比值顯著升高(P<0.05)，Bcl-2/BAX比值遠大于1。見表3。

2.5細胞凋亡數(shù)量的變化 假手術(shù)組大鼠大腦皮質(zhì)內(nèi)可見零星的、散在的TUNEL陽性細胞〔(0.92±0.06)個/視野〕，模型組大鼠血腫周圍皮質(zhì)TUNEL陽性細胞較假手術(shù)組顯著增加〔(6.34±2.01)個/視野，P<0.05〕；補陽還五湯組〔(3.97±1.45)個/視野〕和銀杏葉片組〔(4.65±1.98)個/視野〕TUNEL陽性細胞較模型組顯著減少(P<0.05)。

表1 各組信號通路蛋白表達比較

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；下表同

圖1 各組PI3K蛋白表達變化(DAB，×200)

圖2 各組AKT蛋白表達變化(DAB，×200)

組別EB(μg/g)腦含水量(%)假手術(shù)組4.03±0.7059.97±2.59模型組26.53±1.091)78.76±5.201)銀杏葉片組17.58±0.982)73.56±4.192)補陽還五湯組14.66±0.872)69.87±3.652)

表3 各組腦組織Bcl-2、BAX蛋白的比較

圖3 各組凋亡細胞表達變化TUNEL法(×400)

3 討 論

與腦出血后細胞凋亡密切相關(guān)的通路——PI3K/AKT信號通路，其激活過程大體來講分為四步：①某些物質(zhì)或刺激激活酪氨酸激酶活性受體；②PI3K激活；③絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶激活；④磷酸化以后的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶對下游凋亡靶蛋白進行調(diào)控，來發(fā)揮腦保護效果〔4～6〕?？傊?，PI3K/AKT信號通路激活后，能夠作用于Bcl-2、BAX、Caspase-3、核因子(NF)-κB等下游凋亡靶蛋白，通過激活或抑制它們的表達來發(fā)揮生物學效應(yīng)。本實驗在建立腦出血模型大鼠的基礎(chǔ)上，以補陽還五湯灌胃給藥，發(fā)現(xiàn)給藥組PI3K、AKT蛋白陽性表達顯著升高，細胞凋亡數(shù)量顯著降低，此結(jié)果與李峰等〔7〕在補陽還五湯對腦缺血大鼠的影響研究中所得結(jié)果一致，提示腦出血中補陽還五湯能發(fā)揮抑制神經(jīng)細胞凋亡的腦保護效果必然與PI3K/AKT信號通路的激活密不可分。

BBB通透性的改變作為腦水腫發(fā)生的決定性因素，最終導致了腦水腫現(xiàn)象的出現(xiàn)，兩者作為出血性腦損傷病理性變化的重要方面，對于疾病的發(fā)展與預后起到了很大的影響。BBB通透性破壞引發(fā)的腦水腫對于遲發(fā)性神經(jīng)細胞損傷和凋亡發(fā)揮著促進作用，使細胞功能障礙和壞死現(xiàn)象加重，因此兩者經(jīng)常被選為衡量出血性腦病治療效果的指標〔8〕。本研究發(fā)現(xiàn)，補陽還五湯給藥后，大鼠腦組織BBB通透性降低，腦水腫現(xiàn)象減輕，補陽還五湯發(fā)揮了較好的腦保護效果。Bcl-2、BAX作為Bcl-2家族的兩類標志性凋亡蛋白，Bcl-2/BAX比值直接影響細胞凋亡狀態(tài)—促進或抑制，Bcl-2/BAX比值越大，則對凋亡起抑制作用越明顯，反之，則促進凋亡。二者發(fā)揮作用的方式都是經(jīng)過上游生物學信號激活之后，通過對相關(guān)下游基因的激活來完成的，其中PI3K/AKT信號通路便可激活二者，調(diào)節(jié)兩者之間的比值變化〔9～14〕。本研究中補陽還五湯給藥后，兩者比值發(fā)生顯著性變化，提示由PI3K/AKT信號通路的激活引發(fā)了Bcl-2/BAX值變化。

綜上，補陽還五湯能夠降低BBB通透性，同時亦可激活PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導通路，通過調(diào)控Bcl-2、BAX的陽性表達發(fā)生相應(yīng)變化，即調(diào)節(jié)二者之間的比值來實現(xiàn)減輕腦水腫、抑制細胞凋亡的生物學效應(yīng)。隨著對細胞凋亡和與其機制密切相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導通路的深入研究，我們能夠?qū)δX出血產(chǎn)生更進一步的了解和熟悉，在腦出血的臨床治療中提出更加先進的切入點和治療思路。PI3K/AKT信號通路作為相當重要的凋亡通路，其在被激活以后能夠調(diào)控多種凋亡相關(guān)蛋白和基因，然而由于本實驗內(nèi)容有限，僅僅針對Bcl-2和BAX兩大類凋亡蛋白進行了探究，尚有多種凋亡相關(guān)蛋白和基因有待進一步的研究；與此同時，信號轉(zhuǎn)導通路眾多，其是否能夠激活其他重要的通路仍然不得而知，故其具體的機制亟待進行更深入探索。