袁 晴 馬明洋 鄒雪香 周雙雙 吳安花 朱佩文 譚 鋼 姜 楠 葉 蕾 邵 毅

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科，江西 南昌 330006)

干眼癥是一種淚液的質(zhì)和(或)量發(fā)生改變導(dǎo)致淚膜穩(wěn)定性下降的一種眼部疾病，臨床主要表現(xiàn)為眼睛干澀、畏光、流淚、視物模糊、視疲勞等〔1，2〕。從流行病學(xué)角度來看，早在1997年就已經(jīng)有調(diào)查表明在美國65～84歲人群中干眼癥患病率高達(dá)14.6%〔3〕，我國干眼癥發(fā)病率高于美國，50歲以上女性患病率約為男性的2倍〔4，5〕。羊膜淚道支架是以羊膜為主要物理支撐材料制成的新型支架，從人胎膜的內(nèi)層提取出的羊膜沒有神經(jīng)、血管、淋巴管等特異性組織，因此抗原性較低，韌性較好〔6～8〕，同時(shí)羊膜還可以抑制炎癥反應(yīng)，減少結(jié)膜鱗狀上皮化生〔9，10〕，也有研究表明，羊膜抑制新生血管形成，延緩纖維化，對鱗狀上皮化生有逆轉(zhuǎn)功效〔11〕，本研究探究羊膜淚道支架在預(yù)防圍絕經(jīng)雌兔干眼癥中的應(yīng)用效果。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 羊膜淚道修復(fù)支架(江西瑞濟(jì)生物工程有限公司)，SchirmerⅠ試紙(博士倫公司)，聚氯乙烯塑料薄膜、濾紙(上海半島實(shí)業(yè)有限公司)。

1.2動(dòng)物分組及手術(shù) 選取36只在相對恒溫的潔凈環(huán)境中飼養(yǎng)的雌性新西蘭白兔(由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部提供)，1.5月齡，體質(zhì)量1.5～2.0 kg，分別行裂隙燈顯微鏡、眼底鏡檢查，排除眼前節(jié)及眼底異常，保證Schirmer Ⅰ試驗(yàn)(SIT)≥10 mm/5 min。將36只新西蘭大白兔行雙側(cè)卵巢切除術(shù)后隨機(jī)分為A、B、C 3組(各12眼，均為右眼)：A組手術(shù)后1個(gè)月不進(jìn)行任何處理；B組手術(shù)當(dāng)日將羊膜淚道支架植入淚道5 s后取出觀察1個(gè)月；C組手術(shù)當(dāng)日植入羊膜淚道支架1個(gè)月。分別于植入前和植入后2、4、6 w行SIT、角膜熒光素染色(FL)、光學(xué)相干斷層掃描血管造影(OCTA)及角膜共焦顯微鏡掃描檢查。本研究符合動(dòng)物倫理委員會要求，尊重動(dòng)物生命。

1.3測定羊膜生物力學(xué)特性 由同一操作人員對羊膜樣本進(jìn)行切割，獲取3.5 cm×1.0 cm的實(shí)驗(yàn)樣本，將濕潤的樣本置入負(fù)荷傳感器中施力進(jìn)行拉伸，待其斷裂后記錄其抗拉強(qiáng)度(MPa)和斷裂伸長率(%)。

1.4SIT檢測和FL檢查方法 SIT試驗(yàn)：取有刻度的試紙(5 mm×35 mm)，將其一端反折8 mm置于被測眼下結(jié)膜囊的中外1/3處，其余部分懸空垂直于皮膚表面，5 min后記錄濾紙上淚痕的長度。參照文獻(xiàn)〔12〕標(biāo)準(zhǔn)，以≥10 mm/5 min為正常。每組動(dòng)物均由同一實(shí)驗(yàn)人員操作，動(dòng)物每次檢查時(shí)間、地點(diǎn)、溫度、濕度及照明亮度均相同。FL：給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物滴1滴1%熒光素鈉滴眼液，輔助其瞬目，評分系統(tǒng)參考文獻(xiàn)〔13〕標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：0分：無染色；1分：點(diǎn)狀著染，<30個(gè)點(diǎn)；2分：點(diǎn)狀染色>30個(gè)點(diǎn)，但未發(fā)生融合；3分：浸潤彌漫性染色，沒有斑塊；4分：有熒光素斑塊。

1.5OCTA檢查方法 使用AngioVue OCTA系統(tǒng)(Optovue，Inc.，F(xiàn)remont，CA)的視網(wǎng)膜成像(AngioRetina模式)上的分頻輻去相關(guān)血管成像(SSADA)算法進(jìn)行成像，并使用前段透鏡光學(xué)適配器鏡片。每次掃描參數(shù)固定，橫向分辨率為15 μm，軸向分辨率為5 μm，光束寬度為22 μm，光源以840 nm為中心進(jìn)行，重復(fù)3次。該儀器捕獲后續(xù)的橫斷面掃描(B-掃描)，包含以每秒70 000次的慢性橫向的304×304 A掃描，在3～4 s內(nèi)構(gòu)建3-D掃描〔14〕，在測量角膜全層及角膜上皮層厚度時(shí)關(guān)閉自動(dòng)聚焦功能〔15〕。利用系統(tǒng)軟件將角膜劃分為17個(gè)區(qū)域(以右眼的分區(qū)名稱命名)，角膜中心區(qū)域(M)為角膜中央2 mm直徑范圍，內(nèi)環(huán)、外環(huán)分別為角膜中央5 mm、6 mm直徑范圍。內(nèi)環(huán)、外環(huán)各區(qū)域分別再劃分為上方(S)、鼻上(SN)、鼻側(cè)(N)、鼻下(IN)、下方(I)、顳下(IT)、顳側(cè)(T)、顳上(ST)8個(gè)方位，測量各區(qū)域角膜上皮和角膜全層厚度。

1.6角膜共聚焦顯微鏡檢查 采用共聚焦顯微鏡檢查實(shí)驗(yàn)兔角膜上皮的變化情況，操作步驟參考文獻(xiàn)〔16〕：使用5 g/L愛爾卡因滴眼液進(jìn)行表面麻醉，將兔頭固定于顯微鏡平臺上，保證雙眼平視正前方，緩慢推進(jìn)鏡頭，對中央角膜進(jìn)行全層掃描，選擇清晰有效的圖像進(jìn)行保存，角膜上皮基底細(xì)胞及炎癥細(xì)胞密度使用計(jì)算機(jī)軟件計(jì)算。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism4.00統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、單向方差分析student-t檢驗(yàn)及Dunnett-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1羊膜生物力學(xué)特性 羊膜抗拉強(qiáng)度為 (0.691±0.221)MPa，斷裂伸長率為(19.021±4.321)%。

2.2干預(yù)前后各組SIT檢測指標(biāo)比較 干預(yù)前，3組淚液分泌量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；干預(yù)后2、4、6 w 3組淚液分泌量均顯著少于干預(yù)前(均P<0.05)；C組干預(yù)后淚液分泌量均顯著多于同時(shí)段A組及B組(均P<0.05)，見表1。

2.3各組FL檢測指標(biāo)比較 干預(yù)前，3組FL評分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；干預(yù)后2、4、6 w 3組FL評分均顯著高于干預(yù)前(均P<0.05)；C組干預(yù)后FL評分均顯著低于同時(shí)段A組及B組(均P<0.05)，見表2。

表1 各組干預(yù)前后淚液分泌情況比較

與A組比較：1)P<0.05；與B組比較：2)P<0.05；與干預(yù)前比較：3)P<0.05，表2同

表2 各組干預(yù)前后FL評分比較分)

2.4各組角膜上皮厚度及全層厚度比較 C組各區(qū)域角膜上皮厚度及全層厚度均明顯比A、B組薄(均P<0.05)。C組角膜上皮的ST5、S5、SN5、ST6、S6、SN6區(qū)比M區(qū)薄，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。C組角膜全層的T5、IT5、IN5、N5、T6、N6區(qū)顯著比M區(qū)厚(P<0.05)，見表3，表4。

表3 各組各區(qū)域角膜上皮厚度比較

與A組比較：1)P<0.05 ；與B組比較：2)P<0.05；與本組M區(qū)比較：3)P<0.05，下表同

表4 各組各區(qū)域角膜全層厚度比較

2.5各組角膜共聚焦顯微結(jié)果比較 A組為數(shù)量較多且不均勻的上皮基底細(xì)胞；B組有少量散在分布的光亮的炎癥細(xì)胞，部分上皮細(xì)胞膨脹、變形；C組角膜上皮基底細(xì)胞密度有一定程度下降，但僅有極少數(shù)的炎癥細(xì)胞浸潤。6 w后，C組上皮基底細(xì)胞密度〔(2 853±367)個(gè)/mm2〕顯著少于A組〔(3 816±421)個(gè)/mm2〕和B組〔(3 885±316)個(gè)/mm2，均P<0.05〕；C組炎癥細(xì)胞密度〔(69±16)個(gè)/mm2〕顯著少于A組〔(265±27)個(gè)/mm2〕和B組〔(271±25)個(gè)/mm2，均P<0.05〕,見圖1。

圖1 各組角膜上皮細(xì)胞的共聚焦顯微圖像(×800)

3 討 論

干眼癥發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢，目前可通過局部用藥，淚道沖洗等方法疏通淚道，緩解因淚道阻塞造成的干眼癥，但是這些方法在臨床操作的時(shí)候極易損傷淚道，誘發(fā)纖維細(xì)胞增生導(dǎo)致瘢痕收縮，再次堵塞淚道。研究表明，在結(jié)膜、角膜和瞼板腺中均能發(fā)現(xiàn)性激素受體，干眼癥和性激素缺乏有關(guān)，同時(shí)，缺乏雄激素還可能導(dǎo)致瞼板腺功能障礙〔17,18〕，雖然已經(jīng)有應(yīng)用雌激素進(jìn)行干眼的治療，但其具體的作用機(jī)制還不清楚，雌激素作用于淋巴細(xì)胞時(shí)，可促進(jìn)淋巴細(xì)胞生長、分化、增殖及凋亡〔19〕，也可作用于細(xì)胞內(nèi)參與細(xì)胞因子介導(dǎo)反應(yīng)〔20〕。激素替代療法可以有效緩解干眼癥狀，但是長期服用激素副作用多，如男性前列腺肥大，女性男性化等。本實(shí)驗(yàn)前期采用鬼針草、槲寄生、密蒙花茶等中草藥物用于預(yù)防和治療干眼，效果較好，但其副作用還在隨訪階段〔21～26〕。羊膜淚道支架能在淚道中起到很好的物理支撐作用，具有修復(fù)功能〔27〕，此淚道支架的特點(diǎn)在于它由羊膜材料構(gòu)成，有一定彈性和抗拉伸性能，植入后不排斥，益于治療進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)將羊膜淚道支架植入淚道后，對淚道進(jìn)行封堵，儲留淚液以減少淚液流出，增加眼表淚液含量，維持淚膜穩(wěn)定性，從物理機(jī)械方面緩解干眼癥狀，同時(shí)，減少人工淚液的使用可降低滴眼液中防腐劑的副作用。羊膜在外科手術(shù)中廣泛應(yīng)用，其生物活性成分對角膜神經(jīng)有營養(yǎng)作用，還有瘢痕修復(fù)功能〔28,29〕。

OCTA作為一項(xiàng)新的檢查技術(shù)，也表現(xiàn)出植入羊膜淚道支架后上皮增生減少，角膜上皮和角膜全層厚度均未出現(xiàn)明顯增厚。本實(shí)驗(yàn)顯示羊膜淚道支架對圍絕經(jīng)期雌兔干眼有預(yù)防作用。