張 嶠， 郝少歡， 吳 梅， 帕提古麗·阿爾西丁

(1新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肺癌一病區(qū)， 烏魯木齊 830011； 2新疆喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院腫瘤科， 新疆 喀什 844000)

腫瘤抗血管治療是目前肺癌治療的熱點之一，血管內(nèi)皮細胞(ECs)是覆蓋于血管內(nèi)表面的單層扁平上皮細胞，與其下層的結(jié)締組織共同構(gòu)成血管內(nèi)膜層，具有接受、傳遞信息和分泌血管活性物質(zhì)等功能[1-2]。在腫瘤微環(huán)境作用下，腫瘤血管內(nèi)皮細胞與正常血管內(nèi)皮細胞在基因表達、生物學(xué)行為上具有明顯差異[3]。因此體外構(gòu)建人非小細胞肺癌微血管內(nèi)皮細胞(human non-small lung cancer-microvascular endothelial cells，HNSCLC-MECs)模型，對深入研究腫瘤微環(huán)境下肺癌微血管內(nèi)皮細胞的生物學(xué)行為，基因表達調(diào)控等均具有重要意義。

本實驗通過篩網(wǎng)法、組織塊貼服法、胰酶消化法等方法組合對原代HNSCLC-MECs進行分離、培養(yǎng)、純化并鑒定，為后續(xù)體外研究HNSCLC-MECs在肺癌血管發(fā)生中的作用提供細胞平臺。

1 材料與方法

1.1取材收集新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2017年3月-2017年6月胸外科非小細胞肺癌手術(shù)組織標本。

1.2主要試劑及儀器M199內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司)，IV膠原酶、胰蛋白酶(Sigma公司)，F(xiàn)actor Ⅷ抗體(Abcam公司)，CD34 抗體與二抗、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG-HRP 抗體，兔抗人GAPDH多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，倒置顯微鏡(Olympus )等。

1.3主要試劑配制完全培養(yǎng)液：含醫(yī)用肝素100 U/mL，終濃度為10×104U/L青霉素/鏈霉素于含20%胎牛血清M199培養(yǎng)基。

1.4標本的保存人非小細胞肺癌組織標本經(jīng)無菌取材后置于4℃、M199培養(yǎng)液低溫條件下30 min內(nèi)送至細胞培養(yǎng)室。

1.5人非小細胞肺癌微血管內(nèi)皮細胞原代培養(yǎng)無菌條件下組織標本經(jīng)預(yù)冷PBS 液反復(fù)沖洗至無血液殘留，玻璃勻漿器研磨后無菌200 目鋼篩網(wǎng)過濾收集沉淀。0.25%胰蛋白酶常溫消化90 min，200 目鋼篩網(wǎng)再次過濾收集沉淀。0.5%膠原酶常溫消化90 min，無菌500目鋼篩網(wǎng)過濾后收集血管薄膜樣組織塊。將組織塊置入含M199完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，保持組織塊與培養(yǎng)皿底部接觸，培養(yǎng)基剛沒過組織塊。37℃、5% CO2培養(yǎng)60 h，移出組織塊，選擇周圍細胞貼壁且血細胞較少的培養(yǎng)皿繼續(xù)培養(yǎng)5～7 d。每2～3天更換培養(yǎng)液，共培養(yǎng)7～10 d，倒置顯微鏡觀察HNSCLC-MECs的生長情況。

1.6HNSCLC-MECs的純化及傳代顯微鏡下標記纖維樣細胞生長區(qū)域， 0.25%胰蛋白酶消化30 s～1 min，觀察細胞形態(tài)及脫壁，加入完全培養(yǎng)基終止消化，吹打標記部位，M199培養(yǎng)基漂洗后加入適量完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。當細胞融合度>80%時可進行傳代，應(yīng)用0.25%胰蛋白酶常溫消化2～3 min，待細胞變圓、貼壁運動時加5～8 mL完全培養(yǎng)基終止消化，吹打細胞層，1 200 r/min離心3 min，收集細胞混懸液置新的培養(yǎng)皿中，加入適量完全培養(yǎng)液重懸細胞，吹打混勻。

1.7人非小細胞肺癌血管內(nèi)皮細胞的鑒定

1.7.1 形態(tài)學(xué)觀察 倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況及形態(tài)。

1.7.2 細胞表面標志物免疫組織化學(xué)染色 將HNSCLC-MECs接種至蓋玻片上，37℃，5%CO2培養(yǎng)24 h，4%多聚甲醛室溫固定10 min，PBS清洗 3次，每次5 min。加入Factor Ⅷ抗體與CD34 抗體(稀釋比例1∶200)， 4℃孵育過夜。PBS清洗3次，加入羊抗兔IgG-HRP 抗體，兔抗人GAPDH多克隆抗體(稀釋比例1∶500)，37℃避光孵育1 h。PBS清洗3次，5 μg/mL的DAPI細胞核染色5 min，PBS清洗3次后終止顯色，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.8主要觀察指標人非小細胞肺癌微血管內(nèi)皮細胞形態(tài)學(xué)改變及內(nèi)皮細胞標志物Factor Ⅷ和CD34免疫組織化學(xué)染色。

2 結(jié)果

2.1倒置顯微鏡下觀察原代培養(yǎng)人非小細胞肺癌微血管內(nèi)皮細胞HNSCLC-MECs原代培養(yǎng)24～48 h后可見極少量細胞從組織塊中爬出，形態(tài)不一，部分細胞聚集成團。約60 h后可見少量貼壁細胞，培養(yǎng)5 d后貼壁細胞數(shù)量較前增加，細胞呈三角形，多邊形、短梭型，形態(tài)不一。培養(yǎng)7～10 d后貼壁細胞數(shù)量明顯增多，部分細胞可見圓形細胞核，胞質(zhì)較前飽滿，細胞呈三角形，梭型，棍狀。傳代培養(yǎng)后細胞生長速度明顯加快，傳代9～10 d后細胞數(shù)量>80%，細胞呈短梭型，胞體大，折光性強，單層細胞呈典型“鋪路石”樣改變，可見接觸抑制現(xiàn)象，見圖1。

2.2人非小細胞肺癌微血管內(nèi)皮細胞鑒定結(jié)果選擇2～5代的HNSCLC-MECs，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察HNSCLC-MECs內(nèi)皮細胞特異性抗體Factor Ⅷ及CD34免疫組織化學(xué)染色結(jié)果，可見Factor Ⅷ及CD34抗體表達于細胞膜，CD34呈紅色熒光，F(xiàn)actor Ⅷ呈綠色熒光；DAPI表達于細胞核，呈藍色熒光，表達陽性率>95%，見圖2。

細胞培養(yǎng)3 d

細胞培養(yǎng)5 d

細胞培養(yǎng)7 d

細胞培養(yǎng)10 d

細胞傳代后10 d

圖1體外培養(yǎng)人非小細胞肺癌微血管內(nèi)皮細胞形態(tài)學(xué)觀察(×100)

DAPI

CD34

CD34

CD34和DAPI混合染色

Factor Ⅷ

DAPI Factor Ⅷ Factor Ⅷ和DAPI混合染色

圖2激光共聚焦顯微鏡下觀察人非小細胞肺癌血管內(nèi)皮細胞內(nèi)皮抗體FactorⅧ及CD34的表達(×400)

3 討論

腫瘤新生血管網(wǎng)是腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，血管內(nèi)皮細胞是構(gòu)成腫瘤新生血管的主要成分，具有分泌血管活性物質(zhì)，參與炎癥、免疫反應(yīng)，調(diào)節(jié)腫瘤細胞粘附等作用[4-7]。在腫瘤相關(guān)微環(huán)境作用下，血管內(nèi)皮細胞表現(xiàn)出異常的增殖、遷移等生物學(xué)行為，分泌特定的血管生成因子，參與新生血管的發(fā)生。因此培養(yǎng)獲得腫瘤血管內(nèi)皮細胞對研究腫瘤血管發(fā)生具有重要意義。

常用的血管內(nèi)皮細胞分離方法有免疫磁珠分選法[8]、酶組織消化法[9]、梯度離心法[10-11]、組織塊貼壁法[12-13]等。免疫磁珠分選法是利用細胞表面抗原與帶有特異性抗體的磁珠發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，從而在外磁場中分離細胞。該方法獲得內(nèi)皮細胞較為純凈，但細胞損傷大。酶組織消化法指根據(jù)不同酶消化速率的不同而組合消化分離細胞的方法。該方法對細胞消化時間要求準確，易污染，多次傳代后細胞脫落死亡比例高。梯度離心法是在PercoⅡ密度梯度分選法基礎(chǔ)上根據(jù)不同細胞沉降系數(shù)差異經(jīng)多個PercoⅡ密度梯度獲得內(nèi)皮細胞。組織塊貼壁法是利用內(nèi)皮細胞貼壁生長的特點，將小的組織塊平鋪在培養(yǎng)皿底部，從組織邊緣爬出的細胞為原代細胞。該方法應(yīng)用廣泛，操作方法簡便易行，多與其他方法聯(lián)用。

本實驗為尋找簡便易行的人非小細胞肺癌血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)方法，選擇篩網(wǎng)法、組織塊貼服法與酶組織消化法相結(jié)合獲得原代細胞，經(jīng)2～3次傳代后可獲得純度>80%的人非小細胞肺癌微血管內(nèi)皮細胞。在原代培養(yǎng)的過程中我們發(fā)現(xiàn)：血細胞通常在24 h內(nèi)從組織塊游出，內(nèi)皮細胞在48 h后逐漸從組織塊中爬出，成纖維細胞約為72 h。傳統(tǒng)的做法是將肺組織剪碎至1 mm3的小塊，貼于鋪有1%明膠的培養(yǎng)瓶底部，60 h后移出組織塊，通過換液及傳代去除漂浮的血細胞。但實際情況是部分纖維細胞會在60 h內(nèi)爬出組織塊，因成纖維細胞生長速度快于HNSCLC-MECs，5～7 d后成纖維細胞會覆蓋HNSCLC-MECs，且細胞爬出數(shù)量少，培養(yǎng)周期長。因此本研究將組織塊經(jīng)玻璃勻漿器研磨至近糊狀，經(jīng)篩網(wǎng)過濾后選擇薄膜樣組織貼于培養(yǎng)瓶底部，培養(yǎng)基加至組織塊剛好與培養(yǎng)皿接觸。這樣細胞爬出速度及數(shù)量明顯增多，但更為細小的組織塊更易干燥卷曲。其次本研究對比了組織塊直接貼服培養(yǎng)與經(jīng)0.25%胰蛋白酶、0.5%膠原酶消化后貼壁培養(yǎng)原代細胞爬出速度，比較可見經(jīng)酶消化后內(nèi)皮細胞爬出速度加快，數(shù)量增多。內(nèi)皮細胞的純化是本實驗的一個重點，結(jié)合成纖維細胞較內(nèi)皮細胞對胰酶更敏感，脫壁速度快的特點，采用了短時局部消化法和差速粘附法進行純化。操作過程中應(yīng)注意手法輕柔及無菌操作。同時我們發(fā)現(xiàn)HNSCLC-MECs原代細胞生長緩慢，并沒有典型的“鋪路石”樣改變，但傳代后生長速度明顯加快，細胞形態(tài)逐漸趨于一致。

目前微血管內(nèi)皮細胞的鑒定最常用的標志物為CD31、CD34、F8RA/Vwf、Tie2，研究顯示目前沒有一種標志物可以完全顯示不同時期的腫瘤微血管或單一的內(nèi)皮細胞。相較于CD31和F8RA/Vwf，CD34對較早期的不成熟微血管或內(nèi)皮細胞更為敏感[5,7,14]，F(xiàn)8RA/Vwf是最早發(fā)現(xiàn)的血管內(nèi)皮細胞標志物[15-16]，廣泛存在于血管內(nèi)皮細胞，肝、脾血竇內(nèi)皮組織，淋巴管內(nèi)皮及血小板表面。因此本實驗選擇CD34及Factor Ⅷ 互相驗證共同鑒定所培養(yǎng)細胞是否為血管內(nèi)皮細胞，激光共聚焦顯微鏡觀察可見CD34及Factor Ⅷ均表達于細胞表面，成綠色熒光。

綜上所述，本實驗在傳統(tǒng)培養(yǎng)方法基礎(chǔ)上多次實踐，應(yīng)用組織塊貼壁法、篩網(wǎng)法配合胰酶的短時少量應(yīng)用，成功獲得人肺微血管內(nèi)皮細胞，通過細胞形態(tài)及標志物鑒定符合血管內(nèi)皮細胞性質(zhì)，實驗重復(fù)性好，操作簡便，為體外研究肺癌血管內(nèi)皮細胞生物學(xué)特性及相關(guān)分子機制提供了新的途徑。