郭姝彤， 艾彩蓮， 李寶莉

(延安大學醫(yī)學院， 陜西 延安 716000)

據(jù)WHO統(tǒng)計，全球每年生殖道感染的新發(fā)病例數(shù)高達3.33億[1]。在我國，近半數(shù)城鄉(xiāng)育齡婦女患有一種或多種下生殖道感染，其中細菌性陰道炎、真菌性陰道炎和滴蟲性陰道炎的檢出率最高，而細菌性陰道炎是育齡婦女最常見的陰道感染性疾病。全世界有數(shù)百萬婦女患念珠菌性陰道炎(真菌性陰道炎)，隨著抗生素和皮質(zhì)類固醇藥的普遍應(yīng)用，陰道念珠菌逐漸增多，直接影響到婦女的身心健康與生活質(zhì)量。目前治療的陰道炎藥物已有許多，但市場上尚無兼有治療和保健雙重作用的藥物， 國內(nèi)外也未見由五倍子、 白芷為主藥的 8 味中藥組成的復方液體制劑，因此研究抗菌、消炎、鎮(zhèn)痛、增強免疫力、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、安全性高、方便患者使用和攜帶的藥物顯得尤為重要。

延安大學醫(yī)學院李寶莉教授自發(fā)研制的復方中藥洗劑對各種陰道炎不僅有針對性的治療作用，通過調(diào)整陰陽、補虛瀉實、扶正祛邪的整體辨證觀，治療陰道炎癥并調(diào)節(jié)機體內(nèi)環(huán)境，改善全身狀態(tài)，提高機體抵抗力，增強陰道的自凈作用。其中的8味單藥都具有一定的抑菌作用[2-10]，其研究開發(fā)運用于臨床后將會產(chǎn)生深遠的意義。為此，本研究將復方中藥洗劑選用正交t值法實驗設(shè)計表合理安排出坤泰合洗劑中不同單藥及其劑量配比形成的所有組方，通過體外抑菌實驗篩選出最優(yōu)組方及其劑量配比，為臨床治療陰道炎用藥做前期研究。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 中藥材 白芷、五倍子、人參、石斛、當歸、丁香、珍珠、川芎，以上8味中藥都采購于延安大學附屬醫(yī)院中藥庫。

1.1.2 菌種與培養(yǎng)基 白色念珠菌(Candidaalbicans)ATCC10231、大腸桿菌(Escherichiacoli)ATCC25922、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC25923、厭氧消化鏈球菌(Peptostreptococcusanaerobius)ATCC27337、陰道加德納菌(Gardnerellavaginalis)ATCC14018共5種標準菌株，均購于北京中原公司ATCC標準菌株。肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基購于北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要儀器 DNP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)，MARKⅡ全自動厭氧微需氧培養(yǎng)系統(tǒng)(荷蘭MART微生物公司)，ZHWY-100B型恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司)、高壓蒸氣滅菌鍋(天津博訊實業(yè)有限公司)等。

1.2復方中藥洗劑最優(yōu)組方的確定

1.2.1 組方實驗設(shè)計 采用“正交t值法實驗設(shè)計表”確定復方中藥洗劑中不同單藥劑量配比所形成的所有組方，通過體外抑菌實驗，觀察出不同劑量配比的五倍子、白芷、人參等組成的復方中藥藥液對陰道常見5種ATCC標準菌株體外最低抑菌濃度(MIC)的影響，從而篩選出抑菌效果最好的1個組方，最后確定該洗劑的最優(yōu)組方及其劑量配比。8味單藥即白芷、五倍子、丁香、川芎、人參、當歸、珍珠、石斛，依次分別用A、B、C、D、E、F、G、H表示，設(shè)定1、2兩個水平，1水平為高劑量，2水平為低劑量，見表1。采用“正交t值法實驗設(shè)計表”八因素兩水平安排并設(shè)計12種不同的組方，見表2。

表1 因素水平表/g

表2 正交t值法實驗設(shè)計表

1.2.2 組方體外抑菌實驗方法

1.2.2.1 組方的提取及其制備 在最佳提取工藝條件下[11]，將組方中每味中藥打粉后過篩(按照表2“正交t值法實驗設(shè)計表”的12種組方等比例縮小40倍)，共稱取5.5 g粉末，分別加入200 mL 80%乙醇于圓底燒瓶中，置于索氏提取器中進行藥液初步提取；將初步提取所得藥液抽濾后置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)回收乙醇，干燥后獲得藥物粉末；最后使用10 mL容量瓶進行藥液標定，封口以備用。

1.2.2.2 抑菌實驗 取一接種環(huán)菌液均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，每個平板內(nèi)打4個圓孔，向每個圓孔里加入40 μL相同濃度的不同藥液。將需氧菌于電熱恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)24 h，厭氧菌先放入?yún)捬豕藓笾糜谕慌囵B(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)48 h，待培養(yǎng)好后，測量平板上抑菌圈的直徑。實驗重復10次，結(jié)果取其平均值。

2 結(jié)果

2.112種組方的體外抑菌作用組方(1)～(10)的體外抑菌作用優(yōu)于組方(12)，組方(11)對白色念珠菌、大腸桿菌、厭氧消化鏈球菌和陰道加德納菌的體外抑菌作用優(yōu)于組方(12)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 12種組方的體外抑菌作用

注:與組方(12)比較，▲P<0.05。

2.2最優(yōu)組方的確定組方(1)～(10)的體外抑菌作用優(yōu)于組方(12),經(jīng)比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。組方(1)～(7)、(9)的體外抑菌作用優(yōu)于組方(12),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。組方(1)、(4)的體外抑菌作用優(yōu)于組方(12)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。組方(1)～(10)的體外抑菌作用優(yōu)于組方(12)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。組方(1)～(9)的體外抑菌作用優(yōu)于組方(12)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。組方(1)對白色念珠菌、大腸桿菌、厭氧消化鏈球菌和陰道加德納菌的抑菌作用，見表4～8。

2.3復方藥效學的參數(shù)值8味單藥對5種ATCC標準菌的抑菌作用都以高劑量的貢獻值大，除白色念珠菌的珍珠高劑量和低劑量相當，厭氧消化鏈球菌的人參高劑量和低劑量相當，而陰道加德納菌的石斛以低劑量為大。根據(jù)8味單藥的貢獻值大小，排列順序依次為：白色念珠菌：A1>B1>D1>F1>H1>E1>C1>G1；大腸桿菌：A1>B1>D1=H1>C1=E1>F1>G1；金黃色葡萄球菌：A1>D1>G1>F1>C1>B1>H1>E1；厭氧消化鏈球菌：A1>B1>F1>C1>D1>G1>H1>E1；陰道加德納菌：A1>B1>D1=F1>E1>C1=H2>G1；經(jīng)綜合考慮，單藥的貢獻值由大到小為A、B、D、F、C、H、E、G，即白芷、五倍子、川芎、當歸、丁香、石斛、人參、珍珠粉，見表9。

2.4配伍組的相互作用12種組方中各單藥對5種ATCC標準菌的抑菌作用,有相加或拮抗作用。白色念珠菌：組方(3)～(7)、(9)和(10)相互疊加起相加作用，而組方(1)、(2)、(8)、(11)和(12)相互起拮抗作用；大腸桿菌：組方(1)、(2)、(11)、(12)相互疊加起相加作用，而組方(3)～(10)相互起拮抗作用；金黃色葡萄球菌：組方(2)、(4)、(5)、(7)、(9)和(10)相互疊加起相加作用，而組方(1)、(3)、(6)、(8)、(11)和(12)相互起拮抗作用；厭氧消化鏈球菌和陰道加德納菌：組方(1)、(2)、(5)、(8)、(10)和(12)相互疊加起相加作用，而組方(3)、(4)、(6)、(7)、(9)和(11)相互起拮抗作用，見表10。

表4 12種組方對白色念珠菌的正交t值實驗結(jié)果與組間比較

注：水平1為高劑量，水平2為低劑量。

表5 12種組方對大腸桿菌的正交t值實驗結(jié)果與組間比較

注：水平1為高劑量，水平2為低劑量。

表6 12種組方對金黃色葡萄球菌的正交t值實驗結(jié)果與組間比較

注：水平1為高劑量，水平2為低劑量。

表7 12種組方對厭氧消化鏈球菌的正交t值實驗結(jié)果與組間比較

注：水平1為高劑量，水平2為低劑量。

表8 12種組方對陰道加德納菌的正交t值實驗結(jié)果與組間比較

注：水平1為高劑量，水平2為低劑量。

表9 不同單藥抑菌活性對組方藥效學的貢獻值

注: 參數(shù)值:“+”代表促進作用，“-”表示抑制作用；水平1為高劑量，水平2為低劑量。

表10 12種組方對5種ATCC標準菌的正交t值配伍組相互作用性質(zhì)

注：Q：相互作用指數(shù)，Q>0：協(xié)同作用，Q<0：拮抗作用，Q=0：相加作用。

3 討論

不同中藥提取物的抑菌活性不同，大多數(shù)中藥的有效提取物對細菌、病毒等都有一定的作用[12]。本研究結(jié)果表明，12種組方對白色念珠菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、厭氧消化鏈球菌和陰道加德納菌5種ATCC標準菌株均有一定的抑菌效果，以組方(1)的t值最大，P值最小。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，8味單藥對5種ATCC標準菌株的抑菌作用都以高劑量的貢獻值大，除白色念珠菌的珍珠高劑量和低劑量相當，厭氧消化鏈球菌的人參高劑量和低劑量相當，而陰道加德納菌的石斛以低劑量為大。8味單藥對不同標準菌，貢獻值的大小不同，經(jīng)綜合考慮，單藥的貢獻值大小，排列順序依次為白芷、五倍子、川芎、當歸、丁香、石斛、人參、珍珠。12種組方中各單藥對5種ATCC標準菌株的抑菌作用,有相加或拮抗作用。白色念珠菌：組方(3)～(7)、(9)和(10)相互疊加起相加作用，而組方(1)、(2)、(8)、(11)和(12)相互起拮抗作用；大腸桿菌：組方(1)、(2)、(11)、(12)相互疊加起相加作用，而組方(3)～(10)相互起拮抗作用；金黃色葡萄球菌：組方(2)、(4)、(5)、(7)、(9)和(10)相互疊加起相加作用，而組方(1)、(3)、(6)、(8)、(11)和(12)相互起拮抗作用；厭氧消化鏈球菌和陰道加德納菌：組方(1)、(2)、(5)、(8)、(10)和(12)相互疊加起相加作用，而組方(3)、(4)、(6)、(7)、(9)和(11)相互起拮抗作用。

復方中藥洗劑組方的體外抑菌實驗研究中，12種組方對5種ATCC標準菌株的抑菌作用實驗結(jié)果受外界許多因素的影響，如培養(yǎng)基的類型及其pH值、標準菌的種類、接種菌量的多少、培養(yǎng)的溫度等，體外實驗結(jié)果和臨床應(yīng)用效果也存在差異。故本實驗結(jié)果只是在一定條件下12種組方對5種ATCC標準菌株的體外抑菌作用結(jié)果。

本研究顯示12種組方對5種ATCC標準菌均有一定的抑菌作用，以組方(1)的抑菌效果最強，即高劑量組方為最優(yōu)。組方(1)也是復方中藥洗劑的原方，以白芷和五倍子為君藥(即主藥)，當歸、丁香、石斛、人參和珍珠粉為臣藥，川芎為佐使之藥。

本研究是在復方中藥洗劑單藥體外抑菌實驗的基礎(chǔ)上開展的工作,采用體外抑菌實驗對12種組方初步進行了研究，但不能說明有拮抗作用的組方抑菌效果不好，有待進一步研究。另外，本實驗只是初步進行了最優(yōu)組方篩選的體外抑菌實驗,還需對復方中藥洗劑的體內(nèi)研究，為今后投入臨床應(yīng)用提供可靠依據(jù)。