袁 芳， 李文軍， 夏紅娟， 美麗姑·買買提， 葉 華， 徐 麗

(新疆軍區(qū)總醫(yī)院放療科， 烏魯木齊 830000)

間歇性低壓低氧預(yù)處理(intermittent hypobaric hypoxia preconditioning，IHHP)指將人或動物通過間斷或連續(xù)地暴露于低壓低氧環(huán)境，模擬高原適應(yīng)，適度的低壓低氧刺激可有效調(diào)動機(jī)體的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，以對抗隨后嚴(yán)重的外界傷害刺激[1]。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1)在細(xì)胞生長、分化、組織修復(fù)及炎性因子趨化過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[2]。本研究對不同海拔間歇性低壓低氧預(yù)處理對大鼠放射性肝損傷及肝臟組織TNF-α、TGF-β1表達(dá)的影響進(jìn)行研究，以期為放射性肝損傷的預(yù)防提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料50只雄性SPF級SD大鼠，購自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，體質(zhì)量180～220 g/只，飼養(yǎng)在新疆軍區(qū)總醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)科動物中心(SPF級)。TNF-α、TGF-β1免疫組織化學(xué)試劑盒(Abcom公司)。低壓低氧環(huán)境均在西北特殊環(huán)境人工實(shí)驗(yàn)艙內(nèi)(新疆軍區(qū)總醫(yī)院)進(jìn)行。

1.2動物分組50只SD大鼠隨機(jī)分為5組：對照組(C組)、單純照射組(R組)、3 000 m間歇性低壓低氧預(yù)處理聯(lián)合照射組(IHHP3+R組)，4 000 m間歇性低壓低氧預(yù)處理聯(lián)合照射組(IHHP4+R組)、5 000 m間歇性低壓低氧預(yù)處理聯(lián)合照射組(IHHP5+R組)，實(shí)驗(yàn)開始前適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w。

1.3預(yù)處理及照射方法預(yù)處理方法：實(shí)驗(yàn)中需要的3 000、4 000、5 000 m的高原環(huán)境通過實(shí)驗(yàn)艙艙模擬，將各組大鼠分批次放進(jìn)艙中，設(shè)置好艙內(nèi)的高度及溫度、濕度，待高度升高到設(shè)定的高度后，觀察記錄大鼠的一般情況，6 h后出艙換下一批，各組大鼠每天進(jìn)艙1次，6 h/次，5次/w；照射方法：出艙后的大鼠用3%戊巴比妥鈉腹腔注射(0.1 mL/100 g)麻醉固定后，確定右半肝照射的照射野并在體表標(biāo)記，采用6 MV X射線，照射總劑量(totall dose，DT)=60 Gy，照射野3 cm×2 cm×1.5 cm，源皮距(source skin distance，SSD) =100 cm，照射深度(d)=1.5 cm，單次劑量2 Gy，1次/d，5次/w。

1.4采血取材及免疫組織化學(xué)染色法照射組大鼠照射后6 h， 以3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，打開腹腔找到下腔靜脈采血檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)的變化。采血完成后取1 cm×1 cm×1 cm大小的受照肝組織，10%中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，免疫組織化學(xué)染色按Abcam試劑盒說明書進(jìn)行：組織蠟塊5 μm連續(xù)切片后標(biāo)記，烤片20 min，脫蠟及再水化：二甲苯5 min， 100%乙醇5 min，95%乙醇2 min，90%乙醇2 min，85%乙醇2 min，80%乙醇2 min；PBS溶液洗2遍，切片進(jìn)入過氧化氫溶液孵育10 min，再用PBS溶液洗2遍，每遍5 min；滴加蛋白修復(fù)液室溫放置10 min，PBS溶液洗一遍5 min；滴加一抗，37℃放置1 h；PBS溶液洗4遍，每遍5 min，滴加二抗，室溫放置10 min，PBS溶液洗4遍，每遍5 min；滴加過氧化物酶室溫放置10 min，PBS溶液洗4遍，每遍5 min；配制DAB顯色劑搖勻，滴加顯色劑，顯色后用PBS溶液洗4遍，每遍5 min； 蘇木精染液浸泡40秒，鹽酸溶液脫色，蒸餾水沖洗，80%乙醇2 min，90%乙醇2 min，95%乙醇2 min，100%乙醇4 min，二甲苯4 min；樹膠封片，鏡檢。

1.5免疫組織化學(xué)法陽性表達(dá)判定標(biāo)準(zhǔn)采用半定量分級法，分別對鏡下陽性細(xì)胞的百分比和染色強(qiáng)度進(jìn)行評分。陽性著色細(xì)胞數(shù)：每張切片觀察5個高倍鏡視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞百分比，<5%記為0分，5%～25%記為1分，26%～50%記為2分，51%～75%記為3分，>75%記為4分；陽性染色強(qiáng)度：無色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分。2者所得分?jǐn)?shù)乘積作為陽性等級：0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為陽性(++)，9～12分為強(qiáng)陽性(+++)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理各組數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間計(jì)量資料的比較用單因素方差分析，率的比較采用卡方檢驗(yàn)，組間比較通過Dunnett-t檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1肝功與C組相比，R組大鼠血清ALT、AST水平明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與R組相比，IHHP4+R組大鼠血清ALT、AST水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而IHHP3+R組、 IHHP5+R組大鼠血清ALT、AST與R組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

表1 各組大鼠血清ALT、AST水平的比較

注：與C組比較，*P<0.05；與R組比較，△P<0.05。

2.2免疫組織化學(xué)檢查結(jié)果TGF-β1的表達(dá)主要在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，TNF-α的表達(dá)主要在細(xì)胞質(zhì)，正常大鼠(C組)肝臟TGF-β1、TNF-α呈低表達(dá)，染色淡(圖1)，R組大鼠肝臟TGF-β1高表達(dá)，細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核棕黃色深染，TNF-α高表達(dá)，細(xì)胞質(zhì)深染，IHHP3+R組、IHHP4+R組、IHHP5+R組TGF-β1均高表達(dá)，細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核也呈棕黃色深染，TNF-α不同程度高表達(dá)。R組大鼠肝臟TGF-β1、TNF-α的陽性表達(dá)率均明顯高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；IHHP4+R組的TNF-α陽性表達(dá)率明顯低于R組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；IHHP3+R組、IHHP4+R組、IHHP5+R組TGF-β1的陽性表達(dá)率與R組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2、圖1)。

表2 各組大鼠肝臟TNF-α、TGF-β1的表達(dá)/例(%)

注：與C組比較，*P<0.05； 與R組比較，△P<0.05。

TGF-β1的陰性表達(dá) (×100)

TNF-α的陰性表達(dá) (×100)

TGF-β1的陽性表達(dá)

TNF-α的陽性表達(dá)

2.3相關(guān)性分析肝功與免疫組化的結(jié)果顯示，4 000 m海拔高度預(yù)處理能對放射造成的肝損傷產(chǎn)生一定的保護(hù)作用，本研究對經(jīng)過4 000 m低壓低氧預(yù)處理組SD大鼠肝臟TNF-α、TGF-β1的表達(dá)以及肝功能指標(biāo)ALT、AST進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，經(jīng)過低壓低氧預(yù)處理后，TNF-α表達(dá)與TGF-β1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.802，P=0.005)，TNF-α表達(dá)與ALT呈負(fù)相關(guān)(r=-0.855，P=0.002)，TGF-β1的表達(dá)與ALT呈正相關(guān)(r=0.648，P=0.043)。

3 討論

放射性肝損傷是由于放射治療導(dǎo)致的一種亞急性、慢性肝臟損傷，是胸部和上腹部腫瘤放療及骨髓移植前預(yù)處理中最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，極大地影響了胸腹部腫瘤，特別是肝癌的放療療效[3]，制約著放療劑量的增加。有研究表明IHHP能夠減輕放射性心臟損傷和纖維化[4]。低壓低氧預(yù)處理對機(jī)體具有多種有益作用，如：對抗心臟缺血/再灌注損傷[5]、抗心律失常[6]，并且可以產(chǎn)生神經(jīng)[7]、肝臟保護(hù)作用[8]。近年來關(guān)于低壓低氧預(yù)處理保護(hù)作用方面的研究較多，關(guān)于低氧放療的研究也有不少，武亞晶等[9]研究表明慢性間歇性低壓低氧預(yù)處理可以改善放射線引起的冠狀動脈損傷，提高心臟對缺血再灌注損傷的耐受性，通過抑制氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以及抑制心肌纖維化等對心臟肌發(fā)揮保護(hù)作用。Yuan等[10]的研究結(jié)果提示慢性間歇性低壓低氧預(yù)處理可以通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷減輕大鼠的肝臟損傷。本研究對不同海拔間歇性低壓低氧預(yù)處理對大鼠放射性肝損傷及肝臟組織TNF-α、TGF-β1表達(dá)的影響進(jìn)行研究。

TNF-α、TGF-β1在細(xì)胞生長、分化、組織修復(fù)及炎性因子趨化過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。TNF-α是由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種生物活性因子，是一種主要的促炎性細(xì)胞因子，其表達(dá)受轉(zhuǎn)錄因子核因子κb(NF-κB)的調(diào)控[11]。TGF-β1是一種重要的免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子，能抑制巨噬細(xì)胞激活，肝損傷時主要由枯否細(xì)胞和巨噬細(xì)胞釋放，肝纖維化時則主要由HSC釋放[12]。TNF-α在血液及肝組織的濃度升高，推測TNF-α可能觸發(fā)肝纖維化的開始，使病變由單純性脂肪肝向脂肪性肝炎轉(zhuǎn)變，予以TNF-α抑制劑可明顯改善脂肪性肝炎的病變程度[13]。TGF-β1是已知促進(jìn)HSC激活并分泌膠原纖維的最主要的細(xì)胞因子，在肝纖維化形成過程中起關(guān)鍵作用，是最強(qiáng)的致纖維化因子，促進(jìn)纖維連接蛋白及蛋白多糖等細(xì)胞外基質(zhì)合成與沉積[14]， Yoshida等[15]報(bào)道TGF-β1對肝臟的急慢性炎癥性疾病有明顯的抑制作用，可能與TGF-β1抑制CD4+細(xì)胞向輔助性T細(xì)胞17(Thl7)細(xì)胞分化有關(guān)。

大鼠肝臟經(jīng)過照射后，會出現(xiàn)放射性肝損傷，導(dǎo)致肝功能受損，對肝臟TNF-α、TGF-β1表達(dá)產(chǎn)生影響。Wei等[16]研究結(jié)果表明RILD大鼠肝功檢測ALT、AST以及堿性磷酸酶(ALP)明顯增加。本研究結(jié)果顯示，凡是經(jīng)過照射的大鼠ALT、AST均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，IHHP組與R組相比，4 000 m高原環(huán)境處理后大鼠肝功ALT、AST值有所下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，3 000、5 000 m高度處理后，大鼠肝功與R組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；C組正常大鼠肝臟TNF-α、TGF-β1呈低表達(dá)，R組、IHHP3+R組、IHHP5+R組大鼠肝臟的TNF-α大量表達(dá)，IHHP4+R組的TNF-α表達(dá)較C組高，較其他組低；TGF-β1在R組、IHHP3+R組、IHHP4+R組、IHHP5+R組均大量表達(dá)，與C組相比，R組、IHHP3+R組、IHHP5+R組組TNF-α均高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；TGF-β1在R組、IHHP3+R組、IHHP4+R組、IHHP5+R組均高表達(dá)，異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與R相比，IHHP4+R組TNF-α的表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。肝功與免疫組化的結(jié)果顯示，4 000 m海拔高度預(yù)處理能對放射造成的肝損傷產(chǎn)生一定的保護(hù)作用，4 000 m低壓低氧預(yù)處理組SD大鼠肝臟TNF-α、TGF-β1的表達(dá)以及肝功能指標(biāo)ALT、AST的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，經(jīng)過低壓低氧預(yù)處理后，TNF-α表達(dá)與TGF-β1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，TNF-α表達(dá)與ALT呈負(fù)相關(guān)，TGF-β1的表達(dá)與ALT呈正相關(guān)，說明4 000 m高度預(yù)處理對放射性肝損傷的保護(hù)作用可能是通過降低TNF-α的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，間歇性低壓低氧預(yù)處理對照射后大鼠肝臟TNF-α的表達(dá)有一定的影響，合適的預(yù)處理高度、預(yù)處理的方式會降低TNF-α的表達(dá)，而TNF-α表達(dá)的降低可能對放射性肝損的減輕發(fā)揮重要作用，IHHP也許能為放射防護(hù)提供一種新的防治方法，但還需要更多、更大規(guī)模的研究進(jìn)一步證實(shí)。