范佩文， 秦永輝， 瑪依努爾·阿里甫，王若崢,

(1中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤免疫與放療研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 烏魯木齊 830011； 2新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放療中心， 烏魯木齊 830011)

宮頸癌(cervical carcinoma, CC)是女性生殖系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一，根據(jù)中國癌癥中心統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)，2015年我國新發(fā)的宮頸癌患者近10萬例，其中約3萬例患者死于該病[1]?？梢妼m頸癌仍是我國重大的公共健康問題。宮頸的鱗柱交接部是病毒性腫瘤轉(zhuǎn)化的最大危險(xiǎn)區(qū)域，發(fā)生于該交界區(qū)的多為宮頸鱗狀細(xì)胞癌(cervical squamous cell carcinoma, CSCC)，占宮頸癌的80%[2]。

隨著宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)研究的不斷深入，許多研究已證實(shí)人乳頭狀瘤病毒(humanpapilloma virus, HPV)感染與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。大量研究認(rèn)為HPV16和18等高危型HPV的持續(xù)感染是發(fā)展為宮頸癌的中心環(huán)節(jié)，其感染大約占所有宮頸癌HPV病毒感染的70%，其中能夠引起CSCC的HPV16占50%以上[3-5]。HPV是小而無包膜的雙鏈環(huán)狀DNA，其全基因組為8 kb，能夠編碼6個(gè)具有調(diào)節(jié)功能的早期蛋白(E1、E2、E4、E5、E6和E7)和2個(gè)參與蛋白衣殼形成的晚期蛋白(L1和L2)[6]。其中，L1蛋白是HPV的主要衣殼蛋白，具有較強(qiáng)的免疫源性，能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體免疫球蛋白G(immunoglobulin G, IgG)和免疫球蛋白A(immunoglobulin A, IgA)[7]；L2蛋白為次要衣殼蛋白，與HPV抗原多態(tài)性有關(guān)。L1和L2蛋白主要在病毒顆粒侵入宿主機(jī)體后起協(xié)調(diào)和識(shí)別作用。

目前，關(guān)于HPV16 L1和L2抗原蛋白的研究多見于細(xì)胞涂片及組織切片中，而關(guān)于血液中的免疫應(yīng)答反應(yīng)研究較少，本研究采用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(enzyme-linked immunospot assay, ELISPOT)，使用 HPV16 L1和L2抗原多肽刺激CSCC患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)，檢測(cè)特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)的水平，了解其與患者的臨床特征之間的相關(guān)性，為CSCC患者免疫治療提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象選擇2014年3月-2016年7月就診于新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，經(jīng)病理明確診斷且臨床資料完整的CSCC患者118例為研究對(duì)象?；颊吣挲g34～78歲，中位年齡56歲；根據(jù)2009年國際婦科聯(lián)盟(FIGO)子宮頸癌臨床分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ～Ⅱ期76例，Ⅲ～Ⅳa期患者42例；經(jīng)本院檢驗(yàn)科行HPV定性檢測(cè)，HPV16陽性患者86例，陰性32例。

1.2主要儀器與試劑酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)分析儀(AIDv Spot Reader Spectrum)購自德國AID公司；ELISPOT試劑盒及HPV16 L1和L2抗原肽均由英國牛津大學(xué)MRC人類免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供；含硝酸纖維素膜(PVDF)的96 孔板購自美國 Millipore 公司；胎牛血清、RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基、人淋巴細(xì)胞分離液、植物血凝素(PHA)和磷酸鹽緩沖液(PBS)均購自美國 Sigma 公司；ABC顯色液購自美國Hyclone公司；青鏈霉素和臺(tái)盼藍(lán)購自上海生工生物技術(shù)有限公司。

1.3L1和L2蛋白特異性CTL免疫反應(yīng)檢測(cè)

1.3.1 外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)采集 抽取患者肘靜脈血10 mL(EDTA抗凝)，采用密度梯度離心法分離PBMC，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，將細(xì)胞重懸，調(diào)整終濃度為3×106個(gè)/mL用于進(jìn)行ELISPOT檢測(cè)。

1.3.2 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(ELISPOT)檢測(cè) 從GenBank中篩選出目前世界公認(rèn)的Consensus Subtype序列覆蓋HPV16 L1 58條和L2 57條全基因序列的重疊肽，由牛津大學(xué)MRC人類免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室合成。按照ELISPOT試劑盒的說明書進(jìn)行HPV16 L1和L2抗原重疊肽免疫反應(yīng)檢測(cè)；按說明書配制ALP顯色液，每孔加入100 μL，加蓋后室溫下放置15 min顯色。

1.3.3 ELISPOT實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn) 采用酶聯(lián)斑點(diǎn)分析系統(tǒng)處理數(shù)據(jù)，96孔板上顯示的每一個(gè)斑點(diǎn)都對(duì)應(yīng)一個(gè)分泌細(xì)胞因子的CTL，即斑點(diǎn)形成細(xì)胞(spots forming cell, SFC)，結(jié)果采用SFC/106PBMCs表示。陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)為實(shí)驗(yàn)孔斑點(diǎn)數(shù)≥3倍的陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)，且實(shí)驗(yàn)孔斑點(diǎn)數(shù)≥25 SFC/106PBMCs，陰性對(duì)照孔<30 SFC/106PBMCs[8]。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的2組間計(jì)量資料的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)的比較采用秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用百分比表示，組間差異由卡方或四格表Fisher確切概率法檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1CSCC患者HPV16L1和L2抗原特異性CTL免疫反應(yīng)宮頸鱗癌患者外周血中HPV16 L1和L2特異性CTL免疫應(yīng)答陽性率分別為31.4%(37/118)和16.9%(20/118)；平均反應(yīng)強(qiáng)度分別為36.3及30.3 SFC/106PBMC(圖1)。

圖1 118例CSCC患者外周血中HPV16 L1和L2

2.2CSCC患者HPV16L1和L2抗原特異性CTL免疫反應(yīng)頻率與臨床特征比較HPV16 L1和L2特異性抗原多肽反應(yīng)頻率在臨床分期Ⅰ～Ⅱ期組均高于Ⅲ～Ⅳ期組(40.8%和14.3%，P=0.003；25.0%和2.4%，P=0.002)；在HPV16陽性組均高于陰性組(39.5%和9.4%，P=0.002；22.1%和3.1%，P=0.015)，余臨床特征比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

2.3CSCC患者HPV16L1和L2抗原特異性CTL免疫反應(yīng)強(qiáng)度與臨床特征比較HPV16 L1特異性抗原多肽反應(yīng)強(qiáng)度在組織學(xué)類型中，菜花型>空洞型>結(jié)節(jié)型>其他類型(P=0.019),HPV16 L2特異性抗原多肽反應(yīng)強(qiáng)度在≤56歲組高于>56歲組(P=0.012)，余臨床特征比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

3 討論

宮頸癌仍然是全球范圍內(nèi)最常見的婦科惡性腫瘤。大量研究證明，HPV感染是引起宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的必要條件，其中HPV16、18、31、45、52和58等高危型HPV病毒感染占所有亞型感染的80%，是導(dǎo)致宮頸癌前病變和宮頸癌的最主要因素之一[9]，報(bào)道顯示90%以上的CSCC均可以檢測(cè)到高危型HPV的感染[10]。

表1 118例CSCC患者外周血中HPV16 L1和L2特異性CTL反應(yīng)頻率與臨床特征比較/例(%)

表2 118例CSCC患者外周血中HPV16 L1和L2特異性CTL反應(yīng)強(qiáng)度與臨床特征比較/(SFC/106 PBMCs)

HPV病毒結(jié)構(gòu)簡單，由蛋白衣殼包裹雙鏈閉環(huán)DNA組成的球形顆粒，直徑約為50～55 nm。其蛋白衣殼由主要衣殼蛋白L1和次要衣殼蛋白L2組成，約占病毒總質(zhì)量的80%～90%左右[11]。L1衣殼蛋白是主要的特異性抗原，高度保守，其分子質(zhì)量約為58 kD，能自組裝成在形態(tài)學(xué)和免疫學(xué)上與天然HPV病毒高度相似的類病毒顆粒( virus like particle，VLP)[12]，在病毒感染細(xì)胞初期具有重要作用，參與細(xì)胞表面受體的相互作用[13]。L2衣殼蛋白高度可變，其分子質(zhì)量約為51 kD，協(xié)助L1組裝成病毒顆粒，在病毒感染過程中發(fā)揮重要作用，其參與病毒感染的整個(gè)過程[14]。目前關(guān)于HPV16 L1 VLPs的預(yù)防性HPV疫苗已經(jīng)上市，L2型疫苗也在研發(fā)當(dāng)中。基于這兩個(gè)蛋白的治療性疫苗研究也已開展。Pinto等[15]的一項(xiàng)臨床II期試驗(yàn)結(jié)果顯示，HPV16 L1 VLPs疫苗不僅能引起強(qiáng)烈的B細(xì)胞反應(yīng)，還可誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖，并觀察到了干擾素伽瑪(interferon-γ， IFN-γ)等細(xì)胞因子明顯增加。蔣蓉等[16]構(gòu)建乙肝病毒核心抗原(HBcAg)與HPV L2抗原的融合蛋白，在大腸桿菌中重組表達(dá)形成病毒樣顆粒結(jié)構(gòu)；通過小鼠模型檢測(cè)后得出HBc-L2 VLPs可以有效地增強(qiáng)L2抗原的免疫原性，并可刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)多型HPV的免疫保護(hù)力。Hitzeroth等[17]研究發(fā)現(xiàn)，使用HPV16 L2 DNA疫苗和HPV16 L2蛋白均誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，而被L2 DNA疫苗免疫的小鼠腫瘤體積縮小了50%，這說明L2 DNA的體內(nèi)表達(dá)可以產(chǎn)生細(xì)胞免疫，控制腫瘤生長。以上研究結(jié)果表明，L1和L2蛋白均能誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)，可能成為治療性疫苗的新的靶抗原。

在正常生理情況下，大多數(shù)HPV感染是暫時(shí)性的，約90%的HPV病毒在感染后兩年內(nèi)被宿主的天然免疫系統(tǒng)而自發(fā)性清除，只有宮頸上皮細(xì)胞長時(shí)間受HPV病毒感染刺激而化生不良，導(dǎo)致局部組織癌變[18-19]。研究表明，高危型HPV病毒的持續(xù)性感染導(dǎo)致的宮頸免疫細(xì)胞和炎性細(xì)胞等腫瘤微環(huán)境的紊亂是宮頸癌發(fā)生不可忽視的致癌機(jī)制[20]。HPV感染后誘導(dǎo)T細(xì)胞(惡性腫瘤特異性免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞)的活化，并參與清除病毒感染或CC發(fā)生的病理過程。ELISPOT技術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞對(duì)HPV等病毒抗原肽的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答研究中比較成熟，廣泛應(yīng)用于抗原蛋白重疊肽細(xì)胞表位的篩選及鑒定、治療性疫苗的設(shè)計(jì)、動(dòng)物模型和臨床試驗(yàn)等[21]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果顯示，L1肽段反應(yīng)頻率和強(qiáng)度略高于其他肽段，但由于病例數(shù)較少，各肽段未見明顯差異，需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證[22]。本研究利用ELISPOT技術(shù)檢測(cè)118例CSCC患者外周血中，經(jīng)合成的HPV16 L1和L2抗原重疊肽刺后，分泌IFN-γ的CTL細(xì)胞的免疫水平，陽性應(yīng)答率分別為31.4%和16.9%；平均反應(yīng)強(qiáng)度分別為36.3及30.3 SFC/106PBMC。表明HPV16 L1和L2特異性抗原多肽能夠誘導(dǎo)CSCC患者外周血中的PBMC產(chǎn)生CTL免疫應(yīng)答，該結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)室前期在頭頸部腫瘤中的HPV16 L1和L2陽性率(36.4%和 34.5%)比較顯示[23]，HPV16 L2的反應(yīng)頻率較低，這可能與不同病種、樣本量擴(kuò)大以及陽性率判定標(biāo)準(zhǔn)的優(yōu)化有關(guān)。通過與不同臨床特征的對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，HPV16 L1和L2抗原特異性CTL反應(yīng)頻率在臨床分期Ⅰ～Ⅱ期組均高于Ⅲ～Ⅳ期組(40.8%和14.3%，P=0.003；25.0%和2.4%，P=0.002)；提示這2個(gè)蛋白的免疫應(yīng)答反應(yīng)頻率隨臨床分期的進(jìn)展而降低，可能是因?yàn)橥砥诨颊咦陨砻庖吡λ降拖聦?dǎo)致CTL免疫應(yīng)答減弱；二者的CTL反應(yīng)頻率在HPV16陽性組均高于陰性組(39.5%和9.4%，P=0.002；22.1%和3.1%，P=0.015)，表明CSCC患者HPV16 L1和L2免疫應(yīng)答反應(yīng)與HPV16感染情況相關(guān)，這可能與這2個(gè)衣殼蛋白能夠協(xié)同組裝成具有HPV病毒效應(yīng)的VPLs有關(guān)，有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。在反應(yīng)強(qiáng)度方面，HPV16 L1特異性抗原多肽反應(yīng)強(qiáng)度在組織學(xué)類型中，菜花型>空洞型>結(jié)節(jié)型>其他類型(P=0.019)，這可能是由于納入到本研究中的宮頸鱗癌患者的宮頸外觀以菜花型為主，該因素待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究；L2特異性抗原多肽反應(yīng)強(qiáng)度在≤56歲組高于>56歲組(13.80和7.20 SFC/106PBMCs，P=0.012)，反應(yīng)相對(duì)年輕患者的整體免疫功能可能好于年齡較大者，因此所產(chǎn)生的CTL免疫反應(yīng)強(qiáng)度也越強(qiáng)。

綜上所述，CSCC患者外周血中HPV16 L1和L2抗原肽可以誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性CTL反應(yīng)，并與HPV16感染、臨床分期和組織學(xué)類型等臨床特征有一定相關(guān)性，有待于深入研究驗(yàn)證，有可能成為宮頸鱗癌免疫治療的潛在靶點(diǎn)。