湯光耀，李佳潔，馬斌，姜玉峰，呂海龍*

（1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院肝膽外科，新疆 石河子832008；2石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室，新疆 石河子832008）

細(xì)粒棘球蚴?。╟ystic echinococcosis，CE）又稱囊型包蟲?。╡chinococcosis），是由細(xì)粒棘球絳蟲（Echinococcosis granulosus，Eg）的幼蟲階段寄生于人體或者宿主動(dòng)物而引起的疾病，主要流行于新疆等畜牧業(yè)發(fā)達(dá)的地區(qū)[1]。細(xì)粒棘球蚴病主要發(fā)生在肝臟，治療上以手術(shù)為主。膽瘺是囊型肝包蟲病最常見的并發(fā)癥[2-3]，本課題組[4]在臨床工作中發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)粒棘球蚴病合并膽瘺患者包蟲內(nèi)原頭節(jié)大部分已經(jīng)死亡，并且肝包蟲進(jìn)入膽道后原頭節(jié)無法發(fā)育成包蟲。因此推測(cè)膽汁進(jìn)入囊型肝包蟲囊內(nèi)是導(dǎo)致囊型肝包蟲死亡的原因之一。孫馮等[5]將不同濃度膽汁體外作用于細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)觀察到膽汁可抑制原頭節(jié)的活力。膽汁包含許多成分，具體哪種成分導(dǎo)致細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)的死亡，目前并不清楚。膽汁酸是膽汁的主要成分，膽汁酸具有細(xì)胞毒性，可以破壞細(xì)胞膜的完整性，促進(jìn)活性氧的產(chǎn)生并氧化修飾蛋白等細(xì)胞成分，高濃度膽汁酸可引起肝細(xì)胞變形壞死[6]。研究發(fā)現(xiàn)，疏水性膽汁酸可通過線粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、死亡受體途徑誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡和壞死[7]。本課題組史紅娟等[8]使用不同濃度鵝脫氧膽酸體外作用于原頭節(jié)，發(fā)現(xiàn)鵝脫氧膽酸能夠誘導(dǎo)細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)凋亡，并具有時(shí)間和濃度關(guān)系。但具體鵝脫氧膽酸通過何種機(jī)制誘導(dǎo)原頭節(jié)凋亡并不明確。本實(shí)驗(yàn)擬采用鵝脫氧膽酸（chenodeoxycholic acid，CDCA）體外作用于細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)，檢測(cè)鵝脫氧膽酸對(duì)細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)活力的變化，并通過檢測(cè)氧化-抗氧化相關(guān)蛋白水平變化，初步探討鵝脫氧膽酸誘導(dǎo)原頭節(jié)凋亡的作用機(jī)制，以期為臨床發(fā)現(xiàn)新型抗包蟲藥提供一種理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

含細(xì)粒棘球蚴囊泡的羊肝買自昌吉屠宰場(chǎng)。鵝脫氧膽酸購于美國(guó)sigma公司；Nrf2多克隆抗體購自美國(guó) abcam公司；Caspase-3、ROS、GSH-PX和 TPX檢測(cè)試劑盒均購于南京建成公司；RPMI1640培養(yǎng)基購自上海哈靈生物公司，胎牛血清購自杭州四季青公司。

1.2 原頭節(jié)的體外培養(yǎng)

獲取含細(xì)粒棘球蚴病囊泡的羊肝，用雙蒸水及75%酒精分別清洗肝臟囊泡表面，在無菌條件下抽取含原頭節(jié)的囊液置于培養(yǎng)瓶中，靜置，抽掉上清，用 PBS(PH7.2)液洗滌4～6遍，用0.1%伊紅染液做染色排斥實(shí)驗(yàn)，98%以上拒染時(shí)可用于實(shí)驗(yàn)。將原頭節(jié)移至含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基（青霉素及鏈霉素各100 U/mL）的培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 CDCA作用于細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)

將原頭節(jié)分為空白對(duì)照組及 500、1000、2000、3000 μmol/L CDCA 組。于無菌條件下用PBS清洗體外培養(yǎng)后的細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)至其活力≥98%；取六孔板，按照設(shè)置好的體系及分組加入相應(yīng)培養(yǎng)基，每組培養(yǎng)基中加入約2500個(gè)原頭節(jié)，放于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，從加藥24 h開始，每天抽取100 μL培養(yǎng)液，用0.1%伊紅染色法檢測(cè)原頭節(jié)活力并在倒置顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。無活力或者活力差的原頭節(jié)會(huì)被染成紅色；活力較好的頭節(jié)不被染色，且可活動(dòng)。間隔3天更換培養(yǎng)液，重新加藥。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 Caspase-3的酶活力測(cè)定

取空白組及1000、3000 μmol/L CDCA組作用24、48 h后的細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)，PBS清洗3次后。每3 mg原頭節(jié)中加入120 μL裂解液，超聲破碎（功率、時(shí)間、次數(shù)），4℃12000 g高速離心10 min后，抽取上清液。按照 Caspase-3檢測(cè)試劑盒步驟將反應(yīng)體系加入96孔板中，于37℃避光孵育，待顏色變化較明顯時(shí)，用 Bio-RAD酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度(A405值)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 ROS水平的測(cè)定

收集空白組及 1000、3000 μmol/L CDCA 組作用2、4 d后的原頭節(jié)，更換含DCFH-DA 10 μmol/L無血清培養(yǎng)基，37℃避光孵育1 h，棄培養(yǎng)液，PBS清洗3次，靜置，待自然沉淀后收集原頭節(jié)，用Bio-RAD熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)DCFH OD值，488 nm激發(fā)波長(zhǎng)，525nm 發(fā)射波。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 Western blot檢測(cè)Nrf2蛋白的表達(dá)

收集不同濃度CDCA處理后的原頭節(jié)。用含PMSF（1∶100）的 RIPA裂解緩沖液在冰上裂解 15分鐘，用細(xì)胞超聲破碎機(jī)粉碎，4℃ 12000 g離心10 min，收集上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度。1∶4比例加 5×上樣緩沖液，100℃煮沸樣品 9min，SDS-PAGE分離目標(biāo)蛋白質(zhì)，然后電轉(zhuǎn)膜至 PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的 PBST封閉2 h，4℃一抗孵育過夜，用 PBST漂洗3次，二抗孵育3 h，用PBST漂洗3次后用 ECL發(fā)光液暗室顯影1～3 min。ImageJ軟件測(cè)算β-actin蛋白灰度值與目的蛋白灰度值的比值，并計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 抗氧化酶GSH-Px和TPx活性的測(cè)定

分別取空白組及1000、3000 μmol/L CDCA 作用2、4 d的原頭節(jié)，按照GSH-Px和TPx檢測(cè)試劑盒中所述方法提取原頭節(jié)蛋白，并用超微量紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度。取上清液，按照 GSH-Px和TPx檢測(cè)試劑盒使用說明書方法檢測(cè)原頭節(jié)抗氧化酶活性；用超微量紫外可見分光光度計(jì)檢測(cè)OD值。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)和最小顯著差法(LSD)檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CDCA作用原頭節(jié)后活力的變化

CDCA 作用后的原頭節(jié)活力曲線（圖1）。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，同一藥物濃度下原頭節(jié)存活率逐漸降低；在同一時(shí)間下，隨著藥物濃度的增加，原頭節(jié)存活率也降低。由此表明CDCA誘導(dǎo)原頭節(jié)死亡具有時(shí)間和濃度依賴性。

圖1 CDCA作用后原頭節(jié)的活力變化Fig.1 Survival of E.granulosus protoscoleces after in vitro exposure to CDCA

2.2 CDCA作用后原頭節(jié)體內(nèi)Caspase-3酶活性的變化

體外培養(yǎng)24、48 h后的各組原頭節(jié)分別進(jìn)行caspase-3酶活性檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示。在相同時(shí)間內(nèi)，隨著藥物濃度的增加，caspase-3酶活性逐漸增強(qiáng)，CDCA作用組同空白組比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

對(duì) Caspase-3酶活性檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=655.038，P＜0.05），以 3000 μmol/L CDCA 濃度組 caspase-3酶活性增加更顯著。

圖2 CDCA作用24、48 h后原頭節(jié)caspase-3酶活性變化Fig.2 Activity of caspase-3 in E.granulosus protoscoleces incubated with CDCA for 24 h and 48 h

2.3 CDCA作用后原頭節(jié)內(nèi)ROS水平的變化

CDCA 處理原頭節(jié)2、4 d，采用 DCFH-DA 熒光染色后，CDCA組原頭節(jié)可見綠色熒光，ROS的熒光強(qiáng)度變化見圖3，熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)顯示終濃度1000、3000 μmol/L CDCA 作用 2 d后 ROS 熒光強(qiáng)度分別為對(duì)照組 2.47、3.83倍；作用 4 d后ROS熒光強(qiáng)度分別為對(duì)照組 3.560、4.91倍。由圖3可見ROS隨CDCA藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，ROS水平明顯升高，采用單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1631.77，P＜0.05)。

圖3 CDCA作用2、4 d后原頭節(jié)ROS水平變化Fig 3.Impact of CDCA on ROS level in E.granulosus protoscoleces after 2 d and 4 d post-incubation

2.4 CDCA抑制Nrf2蛋白的表達(dá)

利用western blot技術(shù)檢測(cè)Nrf2蛋白的表達(dá)（圖4），發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，1000、3000 μmol/L CDCA作用2 d后可見Nrf2蛋白表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，作用4 d后可見Nrf2蛋白的表達(dá)明顯降低，說明CDCA可抑制Nrf2蛋白的表達(dá)，破壞了抗氧化防御系統(tǒng)。

圖4 CDCA作用2、4 d后原頭節(jié)內(nèi)Nrf2蛋白的表達(dá)情況Fig.4 Level of Nrf2 protein in E.granulosus protoscoleces incubated with CDCA for 2 d and 4 d

2.5 CDCA對(duì)細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)抗氧化物酶GSH-Px和TPx酶活性的影響

CDCA處理原頭節(jié)后GSH-Px和TPx酶活性檢測(cè)結(jié)果見圖 5，1000、3000 μmol/L CDCA 作用后的原頭節(jié)與空白組相比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=756.033、608.848，P<0.05）。 1000μmol/L CDCA作用原頭節(jié)2、4 d后 GSH-Px和TPx的活性降低，采用單因素方差分析，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=756.033、608.848，P<0.05）。3000 μmol/L CDCA 組GSH-Px和TPx活性呈現(xiàn)類似的變化趨勢(shì)。

圖5 CDCA作用2、4 d后原頭節(jié)內(nèi)GSH-Px和TPx酶活性的變化Fig.5 Impact of CDCA on GSH-Px and TPx activity in E.granulosus protoscoleces after 2d and 4d post-incubation

3 討論

手術(shù)過程中原頭節(jié)外溢是細(xì)粒棘球蚴病復(fù)發(fā)的主要原因[9]，因此術(shù)中使用有效的化學(xué)藥物是極其有必要的[10]，但目前尚未報(bào)道既有效又安全的化學(xué)藥物[11]。有關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)[8]，CDCA能夠誘導(dǎo)細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)凋亡，但具體通過何種機(jī)制誘導(dǎo)原頭節(jié)凋亡并不明確。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著CDCA濃度增加體外抑制細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)的作用越明顯，這同本課題組前期研究具有一致性[8]。原頭節(jié)的活力曲線顯示3000 μmol/L CDCA對(duì)原頭節(jié)的抑制作用顯著強(qiáng)于其他低濃度組 （1000、2000μmol/L CDCA）。此外 2000 μmol/L CDCA 作用2d時(shí)原頭節(jié)的存活率為85%，作用4 d時(shí)其存活率下降到76%。提示CDCA具有潛在的抗肝囊性包蟲病作用。

細(xì)胞凋亡又稱為細(xì)胞程序性死亡，是機(jī)體的一種自我調(diào)節(jié)方式，而當(dāng)機(jī)體的這種調(diào)節(jié)方式被破壞時(shí)則會(huì)誘發(fā)疾病的產(chǎn)生。在不同的病理過程中，由于許多的分子信號(hào)通路均可調(diào)節(jié)caspase-3，故caspase-3通常被當(dāng)做凋亡的關(guān)鍵蛋白。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用鵝脫氧膽酸體外作用于細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)，觀察到鵝脫氧膽酸能誘導(dǎo)原頭節(jié)的凋亡，使caspase-3的酶活性升高，這與相關(guān)文獻(xiàn)[8]的研究結(jié)果類似，進(jìn)一步驗(yàn)證了鵝脫氧膽酸可抑制原頭節(jié)的生長(zhǎng)并可誘導(dǎo)原頭節(jié)凋亡。

氧化應(yīng)激（Oxygen stress）主要是通過使膜脂質(zhì)過氧化從而改變生物膜功能并破壞酶的活性而引起不同程度的細(xì)胞損傷，甚至誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子 2（Nuclear factor E2-related fator 2，Nrf2）是細(xì)胞內(nèi)的一種轉(zhuǎn)錄因子，主要存在如肝臟、皮膚[12]等代謝器官中，可參與維持氧化還原平衡、凋亡等過程[13]。Nrf2是細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的關(guān)鍵因子，在細(xì)胞質(zhì)中與Keap1相結(jié)合，能夠使細(xì)胞逃避不良刺激。

有關(guān)實(shí)驗(yàn)表明[14]，膽汁酸具有的細(xì)胞毒性能破壞細(xì)胞質(zhì)膜，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生，而 ROS可進(jìn)一步增強(qiáng)膽汁酸的細(xì)胞毒性作用，最終誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。有關(guān)研究表明[15]，在體外研究條件下，過量的ROS能夠?qū)е戮€粒體結(jié)構(gòu)受損，產(chǎn)生凋亡誘導(dǎo)因子，從而激活下游的caspase途徑，最終激活caspase-3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而Nrf2主要是通過抑制線粒體途徑起到抗凋亡作用[16]。Nrf2可被外界和內(nèi)部多種刺激因子激活，當(dāng)受到ROS的刺激后，Nrf2被磷酸化并與Keap1解離[17]，之后磷酸化的Nrf2轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)下游抗氧化酶GSH-Px和TPx等基因的轉(zhuǎn)錄，這些酶和蛋白可滅活內(nèi)源性ROS，避免ROS濃度過高誘發(fā)的細(xì)胞損傷[18]，但當(dāng)ROS濃度超過機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)的防御機(jī)制時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致抗氧化系統(tǒng)破壞，會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[17]。

在本研究中，我們觀察到細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)早期就能夠產(chǎn)生ROS。在用 CDCA處理后2、4 d后，我們觀察到細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)內(nèi)ROS明顯增加，并且隨著CDCA藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，原頭節(jié)內(nèi) ROS的水平也明顯的升高，說明CDCA能夠?qū)е略^節(jié)出現(xiàn)氧化損傷；同時(shí)western blot檢測(cè)到原頭節(jié)內(nèi)Nrf2蛋白的表達(dá)降低，抗氧化物酶試劑盒檢測(cè)到其下游基因GSH-Px和TPx的表達(dá)也降低，并且具有濃度與時(shí)間關(guān)系。

目前，許多研究證實(shí)氧化應(yīng)激與腫瘤細(xì)胞凋亡之間存在聯(lián)系，細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化可引起凋亡相關(guān)信號(hào)通路發(fā)生變化，可最終激活caspase-3，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)氧化應(yīng)激參與CDCA誘導(dǎo)原頭節(jié)凋亡的過程中，這提示CDCA誘導(dǎo)細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)凋亡可能是通過氧化應(yīng)激途徑起作用的，但進(jìn)一步的作用途徑的有待下一步研究探討。