邢立行，李智偉，張中洲，王小義，姜慧嬌，陳雪玲，吳向未

（1石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院肝膽外科,新疆 石河子 832008；2石河子大學醫(yī)學院免疫學教研室，新疆 石河子 832002）

缺血性疾病嚴重影響人類的健康，目前針對此類疾病的治療方式包括介入、溶栓、血管移植等，其中血管移植治療效果最佳，例如冠狀動脈搭橋術。然而血管移植物的來源有限，使得探索良好血管替代物成為當前研究熱點。血管組織工程是利用種子細胞、支架材料制備出血管的科學，用以解決血管移植治療中血管來源不足的問題。目前，被用于血管組織工程的種子細胞中研究最多的是間充質干細胞（MSCs）和內皮前體細胞（EPCs）[1]。Craig K 等[2-3]用MSCs作為種子細胞、Zhao Y等[4]用MSCs誘導分化得到的內皮細胞和平滑肌細胞作為種子細胞構建了組織工程化血管都得到理想效果。Quint C等[5-7]用EPCs也成功構建了組織工程化血管。Hjortnaes J等[8]首次證明在體內環(huán)境下EPCs、MSCs可聯(lián)合應用于血管組織工程。本課題組研究發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)體系中MSCs促進EPCs增殖和血管形成[9]，EPCs聯(lián)合MSCs促進血管修復[10]。Gnecchi M等[11]研究發(fā)現(xiàn)MSCs可通過分泌bFGF在內的多種細胞因子促進血管修復及再生，bFGF能促進EPCs分化成內皮樣細胞[12]。綜上所述，MSCs和EPCs都可以用作血管組織工程的種子細胞，這兩種細胞可互相促進增殖、分化等過程，所以本實驗應用未經(jīng)誘導分化成血管細胞的EPCs、MSCs體外構建組織工程化血管，通過檢測CD34（血管內皮細胞特異性標記）、α-SMA（血管平滑肌細胞特異性標記）的蛋白水平探討聯(lián)合應用兩種細胞是否比應用單種細胞更有利構建組織工程化血管及bFGF在構建過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑及儀器

實驗動物:C57BL/6小鼠，4-6周齡，購自新疆醫(yī)科大學實驗動物中心，雌雄不限，飼養(yǎng)在SPF級實驗動物房，（動物合格證號為 SCXK (新)2011-0003)，作為EPCs、MSCs的來源。實驗試劑:低糖 DMEM、TRYPLE EXPRESS均購自 Gibco公司，EGM-2 MV購自Lonza公司，青鏈霉素、胎牛血清均購自Hyclong公司，聚羥基乙酸無紡布支架（PGA 5 cm×10 cm）購自上海Equl公司，0.1%Gelatin Solution明膠、鼠尾膠原、枸櫞酸鈉均購自北京索萊寶生物公司，Murine FGF-basic購自Peprotech公司，兔單克隆抗體[EP373Y]抗CD34、小鼠單克隆抗體 [1A4]抗alpha smooth muscle Actin購自Abcam公司，DAB顯色劑、酶標山羊抗兔IgG聚合物，酶標山羊抗小鼠IgG聚合物購自中杉金橋公司。實驗儀器:低速離心機（Bio-Rad公司），超凈工作臺（Thermo公司），熒光倒置顯微鏡、病理切片機（Leica公司），冰箱（海爾公司），蓋玻片、載玻片（中國江蘇世泰實驗器材公司）。

1.2 細胞分離、培養(yǎng)及鑒定

小鼠骨髓來源MSCs、EPCs的分離、培養(yǎng)及鑒定按本實驗室前期的方法[13-14]進行。將2種細胞分別培養(yǎng)至3代備用。

1.3 PGA支架材料的處理

將PGA剪裁成0.5 cm×0.5 cm大小，用75%酒精、紫外線消毒處理后將其移至24孔板中，吸取30 μL鼠尾膠原均勻涂抹于PGA上備用。

1.4 細胞接種及細胞、PGA復合物的培養(yǎng)

接種細胞分組：EPCs組、MSCs組、EPCs聯(lián)合MSCs組、EPCs聯(lián)合 MSCs加 bFGF(100 ng/mL)培養(yǎng)組。

將3代的EPCs和MSCs用配制好的低糖DMEM(LG-DMEM，1%青鏈霉素，10%胎牛血清)分別制成1.5×106/mL的細胞懸液，其中bFGF組用含bFGF的低糖 DMEM（LG-DMEM，1%青鏈霉素，10%胎牛血清，100 ng/mLbFGF）制細胞懸液，并且這一組后期均用含bFGF的DMEM制作細胞懸液及培養(yǎng)。EPCs組取2 mL EPCs細胞懸液，MSCs組取2 mL MSCs細胞懸液，聯(lián)合組、bFGF組取EPCs和MSCs細胞懸液各1 mL共2 mL，將各組細胞懸液分別移至含PGA的孔板中。標記后移至培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

12 h后將接種過細胞的細胞、PGA復合物移至新24孔板，按以上方法再次接種細胞，共反復接種4次后每24 h換液1次。

1.5 細胞與PGA支架材料的相容性分析

1.5.1 倒置顯微鏡觀察

細胞、PGA復合物培養(yǎng)1周時在倒置顯微鏡下觀察細胞是否貼附在PGA上，以及細胞生長狀態(tài)。

1.5.2 HE染色

細胞、PGA復合物培養(yǎng)1周時，取出復合物并用中性福爾馬林液固定；固定24 h后脫水，常規(guī)石蠟包埋，切片（切片厚4 μm），將脫蠟水化的切片依次浸入蘇木素液（5 min）、酸化伊紅乙醇（1 min），脫水后封片。

1.6 組織學及免疫組織化學染色

1.6.1 HE染色

培養(yǎng)8周的細胞、PGA復合物HE染色步驟同前。

1.6.2 免疫組織化學染色

1.6.2.1 免疫組織化學染色方法

將培養(yǎng)8周后的各組細胞、PGA復合物包埋蠟塊，方法同前。切片后烤片2 h，二甲苯脫蠟5 min×3次；無水酒精、95%酒精、85%酒精、75%酒精梯度脫二甲苯，每次5 min。使用枸櫞酸鈉溶液修復抗原，高壓 8 min；蒸餾水浸洗 5 min×3次；3%過氧化氫常溫孵育10 min阻斷內源性過氧化物酶，蒸餾水浸洗5 min×3次；滴加適量CD34（1∶100）、α-SMA（1∶100）一抗，4℃孵育過夜；次日蒸餾水浸洗5 min×3次；滴加相應二抗，37℃孵育30 min，蒸餾水浸洗5 min×3次；加DAB顯色1～5 min，顯微鏡下觀察著色情況及時用蒸餾水終止染色，蘇木素復染5 min，酒精梯度脫水，二甲苯透明，晾干，中性樹脂封片。

1.6.2.2 免疫組織化學染色結果判定

陽性細胞數(shù)計分：<5%為 0分；6%～25%為 1分 ；26%～50%為 2分 ；51%～75% 為 3分 ；76%～100%為4分。按染色強度計分：無著色為0分；淺棕黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。兩項結果相乘：0～1 分為(-)，2～4 分為(+)，5～8 分為(++)，9～12 分為(+++)；(-)為陰性，(+)為弱陽性，(++～+++)為強陽性。

1.7 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)用 SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行分析，采用均數(shù)±標準差的形式表示，多樣本均數(shù)間比較，方差齊采用單因素方差分析，若方差不齊則采用非參數(shù)檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 細胞與PGA支架材料的相容性分析

細胞、PGA復合物培養(yǎng)1周時，使用倒置顯微鏡觀察到PGA支架纖維呈不規(guī)則、交錯的纏繞樣，大量細胞貼附在PGA支架纖維上，細胞與支架纖維的結合呈串珠狀（圖1A）。HE染色觀察到大量未降解的紫色PGA支架纖維和少量呈紫黑色的細胞核，紅色箭頭所指為貼附于PGA纖維上的細胞；黑色箭頭所指為PGA纖維（圖1B）。以上證明MSCs、EPCs可貼附于支架纖維上并存活良好。但同一細胞、PGA復合物HE染色觀察的細胞量明顯少于倒置顯微鏡觀察到的細胞量，考慮由于培養(yǎng)時間短，細胞與PGA支架貼附尚不夠牢固，并且在HE染色的操作過程中使細胞大量脫落所致。

圖1 1周時細胞與PGA相容性觀察Fig.1 Observation of the compatibility between cell and PGA at 1 weeks

2.2 MSCs聯(lián)合EPCs在體外培養(yǎng)血管的可行性分析

細胞、PGA復合物培養(yǎng)8周時，HE觀察PGA支架纖維已接近降解，細胞數(shù)量明顯增多并填充了原有支架纖維的空間。MSCs組的細胞成空泡狀，細胞之間不緊密。其余組的細胞排列整齊、均勻、緊密，并可見細胞外基質樣成分。組間未見明顯差異（圖2）。

圖2 8周時組織學(HE)觀察（×200）Fig.2 Histology observation at 8 weeks（×200）

免疫組織化學染色結果顯示：各分組α-SMA染色均為陰性，證明各分組中的干細胞都未分化成平滑肌細胞。MSCs組CD34染色為陰性，表明MSC沒有或極少分化成內皮細胞。其余各組的CD34染色均為陽性（圖3）。聯(lián)合組的CD34染色（強陽性）評分明顯高與EPCs組（弱陽性）和MSCs組（陰性），且差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。EPCs組CD34染色評分明顯高于MSCs組，且差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（圖 4）。

圖3 8周時免疫組織化學（CD34）觀察×200Fig.3 Immunohistochemistry(CD34)observation at 8 weeks（×200）

2.3 bFGF在MSCs聯(lián)合EPCs體外培養(yǎng)血管過程中的作用

bFGF組與聯(lián)合組的HE染色觀察細胞增殖、PGA降解均無明顯差異，免疫組織化學α-SMA染色均無著色，bFGF組的CD34染色（強陽性）評分高于聯(lián)合組（強陽性），但差異沒有統(tǒng)計學意義（P>0.05）（圖 4）。

圖4 8周時不同培養(yǎng)組的細胞、PGA復合物免疫組織化學染色(CD34)評分Fig.4 Statistical analysis of immunohistochemical staining(CD34)at 8 weeks

3 討論

目前有許多血管組織工程的構建方法，但都離不開支架材料、種子細胞和細胞因子這三大基礎。支架材料能為種子細胞及細胞分泌的細胞外基質提供支撐，并且有利于代謝。PGA支架材料對多種細胞具有親和、支持及粘附作用，已成功應用于血管組織工程[15-16]。MSCs能分化成多種成熟細胞例如平滑肌細胞、骨細胞、軟骨細胞等[17-18]。EPCs能分化成血管內皮細胞。大量研究用這兩種干細胞誘導分化成的血管細胞構建組織工程化血管，使得過程復雜，并且降低了細胞的增殖能力。

為了保留種子細胞的增殖和分化能力，本實驗首次應用EPCs聯(lián)合MSCs在體外培養(yǎng)條件下構建組織工程化血管，結果證明EPCs聯(lián)合MSCs培養(yǎng)比單種細胞培養(yǎng)更有利于細胞存活，并且更利于分化成內皮細胞標記陽性的細胞，即EPCs聯(lián)合MSCs更利于形成血管內皮細胞。

細胞、支架材料復合物的培養(yǎng)環(huán)境分為靜態(tài)環(huán)境和動態(tài)環(huán)境，靜態(tài)環(huán)境即細胞與支架在靜止狀態(tài)下、沒有任何外界刺激的培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)。動態(tài)環(huán)境分體內和體外，體外為模擬動物體內環(huán)境也稱為生物反應器[19]。生物反應器即模擬體內血管的搏動和血流對血管管壁的沖刷、壓力刺激[20-21]，是目前較為理想培養(yǎng)方式。而本實驗采用體外靜態(tài)培養(yǎng)的方法，未應用力學因素刺激，可能為本實驗各組細胞、PGA復合物培養(yǎng)后均無平滑肌細胞的重要因素。細胞因子在血管形成過程中的作用是最復雜的?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)近40種促血管生成因子，研究較多的有血管內皮細胞生長因子、bFGF、血管生成素和血小板衍化生長因子。bFGF具有多種生物學活性，能促進血管內皮細胞增殖，且能調節(jié)新生血管的形成。本實驗中單獨bFGF的應用無法達到理想的促血管生成作用，后期可嘗試聯(lián)合應用其他細胞因子進一步研究出理想細胞因子組合，以促進組織工程化血管的構建。

綜上所述，本實驗初步證明了MSCs、EPCs直接在體外聯(lián)合培養(yǎng)構建組織工程血管可行性，但培養(yǎng)的血管組織不完整，無平滑肌細胞。在后期研究中可應用生物反應器培養(yǎng)本實驗中構建的細胞、PGA復合物，并bFGF聯(lián)合其他細胞因子共同應用。進一步促使EPCs聯(lián)合MSCs在體外培養(yǎng)出既有血管內皮細胞又有血管平滑肌細胞的完整血管壁，甚至培養(yǎng)出完整的并具有一定強度和生長性的血管，應用于血管移植治療，有望解決臨床治療過程中血管移植物來源不足的難題。