陶周善 周皖舒 江云云 吳興凈 王林 楊民 謝加兵 徐祝軍

1.皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，弋磯山醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，安徽 蕪湖 2410002.皖南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院老年病科，安徽 蕪湖 241000

骨組織的形成和重吸收之間的動態(tài)平衡受成骨細胞和破骨細胞的調控，隨著年齡的增長，特別是對于絕經后婦女，當骨吸收率超過骨形成速率時，骨組織會被破壞，這可能會導致骨質疏松癥[1]。隨著社會老年人群不斷增加，近年來骨質疏松癥成為繼冠心病后危害人群健康的全球性問題[2]。這類患者一旦發(fā)生骨折或缺損，需要整形手術進行骨修復，但是這類患者本身骨質較差，大都年齡較大且合并較多的基礎疾病，自體骨移植很難滿足骨缺損修復的需要[3]。近年來隨著生物組織工程的不斷發(fā)展，一系列人工生物材料被應用于臨床并取得較好的效果，其中以磷酸鈣材料使用最為廣泛，但是這類材料在骨質疏松狀態(tài)下表現不佳[4]，主要由于骨質疏松狀態(tài)下局部成骨能力顯著下降，嚴重影響材料的骨誘導作用的發(fā)揮[5]。近些年的研究表明局部添加鍶離子(Sr)或骨形成蛋白-2(BMP-2)可以顯著促進骨材料的骨誘導能力，加速骨愈合[6,7]；同時骨材料中摻Sr可以促進局部形成BMP-2來促進骨誘導，增加材料骨的誘導能力[8]。鑒于此，是否可以通過外界添加BMP-2和Sr來共同促進骨愈合。本研究通過局部添加BMP-2和Sr制成負載BMP-2摻鍶磷酸鈣復合材料，通過其對大鼠成骨細胞增殖和分化的影響來探索這種材料治療骨質疏松骨缺損的細胞學可行性。

1 材料和方法

1.1 試劑與材料

二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(Sanyo公司)；骨保護素(osteoprotegerin, OPG)、核因子κB受體活化因子(receptor activator of nuclear factor-KB, RANK)和核因子κB受體活化因子配體(ligand of receptor activator of nuclear factor-κB, RANKL)多克隆抗體(SantaCruz公司)，倒置相差顯微鏡(Olympus 公司)；碘佛醇(武漢遠城科技發(fā)展有限公司)；多功能酶標儀(BioTek 公司)；磷酸四鈣，無水磷酸氫鈣和無水磷酸氫鍶(上海熹垣生物科技有限公司)；胎牛血清(Sciencell 公司)；磷酸鈣干粉(上海玉研科學儀器有限公司)；α-MEM 培養(yǎng)基(維森特公司)；CCK-8 試劑(日本同仁化學研究所)；磷酸(深圳市思美泉生物科技有限公司)；堿性磷酸酶(ALP)檢測試劑盒(購于碧云天公司)；茜素紅S染色液(索萊寶公司)；成骨細胞(SD 大鼠胎鼠顱骨分離所得)。

1.2 材料制備

負載BMP-2摻鍶磷酸鈣復合材料制備：摻鍶磷酸鈣固相成分通過磷酸四鈣，無水磷酸氫鈣和無水磷酸氫鍶按照1∶0.75∶0.25質量比例充分混合而成，固化劑為0.5 mol/L稀磷酸，在室溫、100%相對濕度條件下分別固化 24 h，制成直徑1 mm，厚1 mm 樣品(固化時粉、液質量比為2∶1)；將上述制作完成的5%摻鍶磷酸鈣，按每1 g 5%摻鍶磷酸鈣攜載 0.4 mg的比例稱取BMP-2材料 0.4 mg，加入 0.6 mL碘佛醇注射液中，震蕩混勻直至溶解，同時加入1 g 新制備的5%摻鍶磷酸鈣，4 ℃ 固化保存?zhèn)溆谩Ａ姿徕}干粉和0.5 mol/L稀磷酸按照固化時粉、液質量2∶1制備單純磷酸鈣材料。

1.3 成骨細胞的培養(yǎng)

本研究分為3組：即空白對照組(Con組)、磷酸鈣組(CPC組)和復合材料組(BSCPC 組);將第四代大鼠成骨細胞以2×105個/孔的密度接種到96 孔板中，CPC 組和BSCPC 組的培養(yǎng)液中分別加入磷酸鈣和負載BMP-2摻鍶磷酸鈣，37 ℃, 5%CO2，飽和濕度下培養(yǎng)，隔日換液。

1.4 材料共培養(yǎng)對成骨細胞的影響

1.4.1細胞增殖情況：將成骨細胞以2×105接種于96孔板(37 ℃，100%相對濕度，5%CO2)中。CPC 組和BSCPC組在每個孔中分別加入磷酸鈣和負載BMP-2摻鍶磷酸鈣以在24 h后代替培養(yǎng)基。使用細胞計數試劑盒CCK-8 試劑盒在第1、3、5和7 d測定細胞增殖。 通過分光光度計在450 nm處檢測上清液的光密度(OD)。

1.4.2成骨細胞ALP活性染色：將成骨細胞以2×105接種于24孔板，CPC 組和BSCPC組在每個孔中分別加入磷酸鈣和負載BMP-2摻鍶磷酸鈣，用細胞分化液共培養(yǎng)14 d。使用ALP酶活性染色試劑盒測定ALP活性，其通過底物的藍色指示ALP活性。 在光學顯微鏡下獲得圖像。

1.4.3成骨細胞茜素紅染色：將成骨細胞以1×105接種于24孔板，CPC 組和BSCPC組在每個孔中分別加入磷酸鈣和負載BMP-2摻鍶磷酸鈣，并與其一起共培養(yǎng)21 d。使用茜素紅試劑盒染色檢測細胞礦化能力，其通過改變底物的顏色來指示細胞礦化紅色。在光學顯微鏡下獲得圖像。

1.4.4OPG、RANK、RANKL蛋白表達情況：按上述方案培養(yǎng)到14 d，提取細胞總蛋白，加熱變性后，于-20 ℃保存。取蛋白30 μL，進行 SDS-PAGE 凝膠電泳，將分離后的蛋白質電轉移到 PVDF 膜上，用封閉液封閉濾膜 4 h，依次結合相應濃度的抗OPG、RANK及RANKL和抗β-actin抗體(1∶1 000)，于4 ℃孵育過夜，洗膜后，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔/兔抗鼠(1∶2 000)，孵育1 h。用化學發(fā)光法曝光膠片，沖洗顯色，檢測相應蛋白條帶。用凝膠成像分析系統掃描分析蛋白條帶。

2 結果

2.1 共培養(yǎng)對成骨細胞增殖影響

經過不同材料共培養(yǎng)1、3、5和7 d，CCK-8檢測的結果如圖1所示，相對于Con組，CPC 組和BSCPC組的成骨細胞數目明顯增加，和對照組比較相比，差異有統計學意義(P<0.05)，且以BSCPC組成骨細胞數目最多(P<0.05)，這表明負載BMP-2摻鍶磷酸鈣對成骨細胞增殖促進作用顯著。

圖1 成骨細胞增殖情況注：與Con組比較，*P<0.05；與CPC 組比較，#P<0.05Fig.1 The proliferation of osteoblasts

2.2 成骨細胞茜素紅染色及堿性磷酸酶活性

經過不同材料共培養(yǎng)14 d及21 d，各組堿性磷酸酶染色及細胞茜素紅染色的結果如圖2 A、B所示，定量結果如圖2 C、D所示，結果表明CPC 組和BSCPC組的成骨細胞的礦化能力及ALP活性明顯增加，和對照組比較相比，差異有統計學意義(P<0.05)，且以BSCPC組細胞鈣化能力最強及ALP活性最高(P<0.05)，這表明負載BMP-2摻鍶磷酸鈣可以顯著提高成骨細胞礦化能力及ALP活性。

2.3 成骨細胞OPG、RANK及RANKL表達情況

經過不同材料共培養(yǎng)7 d，各組細胞OPG、RANK及RANKL蛋白表達的結果如圖3 A所示，定量結果如圖3 B所示，結果表明CPC 組和BSCPC組的成骨細胞的OPG表達明顯增加，而RANK及RANKL蛋白表達明顯降低，與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，且以BSCPC組的成骨細胞蛋白OPG、RANK及RANKL蛋白表達量改善最為顯著(P<0.05)，這表明負載BMP-2摻鍶磷酸鈣對成骨細胞OPG、RANK及RANKL蛋白表達影響顯著。

圖3 各組細胞OPG、RANK及RANKL蛋白表達情況注：A 各組細胞OPG、RANK及RANKL蛋白表達的結果；B 定量結果(與Con組比較，*P<0.05；與CPC 組比較，#P<0.05)Fig.3 The protein expressions of OPG, RANK, and RANKL in each group

3 討論

修復由創(chuàng)傷、腫瘤、感染等原因引起的骨缺損仍然是骨科醫(yī)生面臨的主要挑戰(zhàn)之一。盡管自體骨多年來一直被認為是骨移植材料的金標準，因為其優(yōu)異的成骨組合(含有活的祖細胞)、骨誘導(含有許多能夠募集祖細胞和/或異位骨形成的生長因子)和骨傳導(能夠支持三維組織向內生長和未來的新骨形成)[9]。由于供應有限，供體部位的并發(fā)癥以及疾病傳播的風險，自體移植和同種異體移植在臨床中應用受到限制[10]。近年來隨著骨生物材料制造技術不斷發(fā)展，組織工程骨在骨缺損修復巨大潛力越來越受到人們的重視[11]。迄今為止，合成的骨移植替代品中磷酸鈣類的生物材料是最有希望的，由于其與骨礦物狀態(tài)下的化學結果相似[12]。盡管如此，合成骨移植物的性能仍然不如自體移植物，由于缺少必要的骨誘導性能。

近年來主要通過這幾種方案來提高磷酸鈣材料修復骨缺損的能力，包括將它們與促骨形成因子，細胞和無機添加劑結合來加強其修復效果[13]。將鎂(Mg)，鍶(Sr)等無機添加劑摻入合成骨移植物中越來越受歡迎，因為這些添加劑可能直接誘導細胞的變化，例如通過離子通道，潛在地起到“合成生長因子”的作用[13]。這些生物無機物在骨組織中的潛在作用以及它們對骨形成的作用，在我們早期發(fā)表的文獻已經證實[6]。在骨組織工程中已經進行了大量的努力以將成骨生長因子與支架結合以控制它們的釋放，從而以最小的副作用再生骨缺損[14]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是轉化生長因子-β (transforming growth factor-β，TGF-β)超家族成員，在調節(jié)細胞增殖、凋亡、分化和器官發(fā)生中起著至關重要的作用[15]。據報道，在通過縮短手術時間和降低住院費用方面，使用BMP-2比“金標準”自體骨移植更有優(yōu)勢，然而BMP-2使用也帶來了一部分副作用，這些副作用歸因于局部高劑量BMP-2不受控制的釋放；同時一些研究顯示了BMP-2的使用與癌發(fā)生之間的聯系[16]。

本研究中通過組織工程手段合成負載BMP-2摻鍶磷酸鈣復合材料，我們BMP-2劑量較低，同時由于材料組添加了Sr，即可通過刺激局部合成骨形成相關因子彌補BMP-2劑量不足對骨形成誘導能力降低的影響，有潛力在降低BMP-2劑量的同時不降低骨誘導效果。我們的研究結果顯示BSCPC組的成骨細胞增殖情況顯著優(yōu)于Con組和CPC組；同時BSCPC組ALP染色和茜素紅染色結果顯示該組成骨細胞的活性更高，且礦化能力更強；BSCPC組成骨細胞OPG、RANK及RANKL蛋白表達的結果更好的表明負載BMP-2摻鍶磷酸鈣復合材料能改善成骨細胞成骨能力。我們認為負載BMP-2摻鍶磷酸鈣復合材料較單獨復合BMP-2或添加Sr具有較大的優(yōu)勢，既可以避免局部大劑量BMP-2爆發(fā)性釋放出現的不良反應[16]；同時由于Sr這類無機材料通過改善成骨因子來促進成骨[17]，不同于BMP-2直接作用成骨細胞，對后續(xù)的骨形成促進作用意義重大。

總的來說，我們研究證實了負載BMP-2摻鍶磷酸鈣復合材料對成骨細胞增殖分化和改善細胞活性和功能方面的作用顯著；本研究也有不足之處，分組較少，且體內實驗尚未進行；且這種材料和較高劑量的單獨摻BMP-2磷酸鈣復合材料或較高劑量的單獨摻鍶磷酸鈣復合材料成骨效果尚未進行比較，因此后期進一步研究這種復合材料的優(yōu)勢顯得非常有必要。