辛雅莉，王建文,2，曾亞琦,2，姚新奎,2，孟 軍,2，王菊花

(1.新疆農業(yè)大學動物科學學院，烏魯木齊 830052；2.新疆農業(yè)大學馬產業(yè)研究院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】兒茶酚胺氧位甲基轉移酶(catechol-O-methyltransferase，COMT)是目前研究得最為廣泛的神經遞質相關基因，其產物為 COMT酶，可催化多巴胺、去甲腎上腺素、腎上腺素及雌激素的降解[1]。COMT 在 Mg2+作用下催化由S-腺苷蛋氨酸提供的甲基轉移到兒茶酚胺類物質的苯環(huán)3位羥基上，形成 3-甲氧基-4-羥基衍生物，從而使上述各物質降解[2]，從而進一步影響人或動物機體產生某些特殊行為(攻擊、競爭等)，在受到某些特殊刺激的情況下，相關行為表現(xiàn)更為明顯。通過特有行為的產生，會導致機體的生理生化指標發(fā)生變化甚至形成某些病癥。在人類的COMT基因中，發(fā)現(xiàn)其由6個外顯子組成，還有兩個非編碼的可選的啟動子[3]。由于該基因在5'端的不同，表達合成兩種酶：一種是膜結合蛋白(MB-COMT)，主要表現(xiàn)在大腦中，主要由前額葉皮質的多巴胺能神經元支配[4]，涉及到膽堿、多巴胺、去甲腎上腺素等多種遞質的合成、轉運、降解等代謝環(huán)節(jié)，認知的很多過程，特別是執(zhí)行能力與這種膜結合蛋白關系密切；另一種是可溶性形式蛋白(S-COMT)在不同組織中均有表達。這兩種形式的蛋白均參與了兒茶酚胺的分解代謝[5]。伊犁馬性能與馬匹的氣質、行為有著密切的關系。通過研究伊犁馬COMT基因的多態(tài)性及其與心率的關聯(lián)關系，為該基因功能性研究提供系統(tǒng)的基礎數(shù)據(jù)和資料，對馬匹的選擇及早期選育具有重大意義。【前人研究進展】目前對COMT基因研究較為廣泛，在人類疾病相關的研究中，COMT 基因的多態(tài)性會影響與兒茶酚胺、腎上腺素、去甲腎上腺素和多巴胺代謝相關疾病[6]。同時發(fā)現(xiàn)多態(tài)性對認知、性格等有一定影響，這種影響與工作記憶密切相關，在不同基因型個體中工作記憶能力存在差異[7]。具體原因是由于多巴胺等神經遞質的失衡，根據(jù)病因或大腦損害部位的不同，從而影響前額葉皮質功能，進一步導致記憶、執(zhí)行功能、語言、運用、視空間結構技能等一項或多項功能缺陷[8]，比如男性精神分裂癥的暴力行為[9]及重度抑郁癥[10]等。此外，有研究發(fā)現(xiàn)廣西紅水河流域長壽家系COMT基因多態(tài)性與血壓、血脂水平等相關[11]。在幾乎所有的哺乳動物組織中都發(fā)現(xiàn)有 COMT 的分布。人和大鼠的肺 COMT 酶活性較高[12]。人、鼠、兔、猴、豬、雞和狗的紅細胞都發(fā)現(xiàn)了COMT，而且COMT酶活性存在差異，大鼠的偏高，人的偏低[13]。有研究顯示，不同基因型COMT酶活性也存在差異[14]。目前已篩選出了眾多與狗、馬、鼠等動物行為、性格有關的候選基因，其中就有COMT基因。動物存在分離焦慮癥，小鼠、犬、猴子和豬等具有分離焦慮行為與COMT基因多態(tài)性有關[15]。敲除COMT基因可導致雄性小鼠產生攻擊性行為，可導致雌性小鼠情緒低落[16]。楊虹等[17]研究發(fā)現(xiàn)COMT基因對馬的競爭性行為也有較大影響?！颈狙芯壳腥朦c】馬匹的工作性能與其氣質和行為有著密切的聯(lián)系，特別在運動性能方面尤為明顯。心率作為一個重要的生理指標，能夠客觀評價出動物在應對外界不同程度壓力與刺激下的反應[18]，一定程度上反應了馬匹的氣質和行為。氣質、行為等性狀是神經元及由神經元所構成的神經元回路對外界刺激的綜合性反應，COMT酶對其有重要的調節(jié)作用[19]。針對目前相關研究有限，開展伊犁馬COMT基因的多態(tài)性及其與心率的關聯(lián)研究?！緮M解決的關鍵問題】從分子生物學角度，對伊犁馬COMT基因的多態(tài)性及其與心率的關聯(lián)進行研究，為馬匹的選擇鑒定、合理利用與品種培育提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗動物

選取新疆伊犁昭蘇馬場35匹伊犁馬，其中公馬3匹，母馬32匹，使用枸櫞酸鈉抗凝真空采血管，頸靜脈采血3 mL，-20℃保存，用于提取馬匹基因組DNA，同時采集伊犁馬靜息心率、溫和刺激心率及劇烈刺激心率。

1.1.2 主要試劑及儀器

Tris堿、Tris飽和酚、DL2000 DNA Marker、6×Loading Buffer、EDTA、NaOH、NaCl、氯仿：異戊醇(24∶1)、無水乙醇、SDS、硼酸、瓊脂糖、超純水、2×TaqPCR Mix。

水平電泳槽、電泳儀、電子分析天平、高速離心機、凝膠成像系統(tǒng)、PCR儀、酶標儀等。

1.2 方 法

1.2.1 心率數(shù)據(jù)信息

使用polar v800心率表對馬匹靜息心率、溫和刺激心率及劇烈刺激心率進行采集。

1.2.2 引物設計及PCR擴增

采用酚—氯仿法對伊犁馬血液樣品基因組DNA進行抽提。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，使用酶標儀對DNA濃度進行測定，-20℃保存。

參照GenBank中公布的位于馬8號染色體上的COMT基因序列(登錄號NC_009151)，以COMT基因第1外顯子為目標片段，采用Primer5.0軟件設計引物，引物序列為：F：5'-CACAAAGCACTGAAGCCTGG-3'；R：5'-GTGTCAGGGTCTCAGCAAGG-3'，預計片段長度為538 bp。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

PCR反應體系20 μL：ddH2O 8.0 μL、2×TaqPCR Mix 10 μL、上下游引物各0.5 μL、DNA模板1.0 μL。PCR反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，61℃退火30 s，72℃延伸35 s，33個循環(huán)，72℃延伸10 min；4℃保存。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。目的片段送由上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

將測序得到的DNA序列用 DNAStart軟件進行序列拼接、比對，篩選SNPs位點。應用Excel軟件分別計算不同位點在受試群體中的基因型頻率、等位基因頻率、有效等位基因數(shù)(Ne)、群體遺傳純合度(Ho)、多態(tài)信息含量(PIC)并檢驗是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。采用Haploview 4.2軟件計算SNPs的連鎖不平衡參數(shù)，并構建單倍型。采用SPSS 20.0軟件對基因多態(tài)性與心率進行關聯(lián)分析。

2 結果與分析

2.1 基因測序

研究表明，在試驗選取馬匹COMT基因第1外顯子上發(fā)現(xiàn)8個突變位點，各突變位點的具體信息如表1所示。其中SNP1突變?yōu)殄e義突變，突變使得COMT的第36個氨基酸由天冬酰胺變?yōu)楣劝彼幔?SNP2突變?yōu)殄e義突變，突變使得COMT的第37個氨基酸由谷氨酸變?yōu)橘嚢彼幔?SNP3突變?yōu)闊o義突變，突變使得COMT至第38個氨基酸轉變?yōu)榻K止子； SNP4突變?yōu)殄e義突變，突變使得COMT第39個氨基酸由異亮氨酸變?yōu)槔i氨酸； SNP5突變?yōu)殄e義突變，突變使得COMT第59個氨基酸由組氨酸變?yōu)楣劝滨０罚?SNP6突變?yōu)橥x突變； SNP7突變?yōu)殄e義突變，突變使得COMT第88個氨基酸由天冬酰胺變?yōu)楫惲涟彼幔籗NP8突變?yōu)殄e義突變，突變使得COMT第91個氨基酸由天冬氨酸變?yōu)樘於０?。?

表1 COMT基因第1外顯子SNPs信息

Table 1 The information of SNPs of COMT gene exon1

位點SiteEquCab 3.0位置EquCab3.0 Position突變類型Substitution type氨基酸位置Amino acid position氨基酸Amino acidSNP1g.429149 A>C錯義突變36Asn-GluSNP2g.429152 G>A錯義突變37Glu-LysSNP3g.429157 C>A無義突變38終止SNP4g.429158 A>G錯義突變39Ile-ValSNP5g.429220 T>A錯義突變59His-GlnSNP6g.429286 G>A同義突變81SerSNP7g.429306 A>T錯義突變88Asn-IleSNP8g.429314 G>A錯義突變91Asp-Asn

2.2 遺傳學

對檢測出的突變位點進行基因(型)頻率及多態(tài)信息含量等參數(shù)進行計算。研究表明，SNP2和SNP6只檢測到兩種基因型，其余6個突變位點均檢測到三種基因型。SNP1優(yōu)勢等位基因為A，優(yōu)勢基因型為AA；SNP2優(yōu)勢等位基因為G，優(yōu)勢基因型為GG；SNP3優(yōu)勢等位基因為C，優(yōu)勢基因型為CC；SNP4優(yōu)勢等位基因為A，優(yōu)勢基因型為AA；SNP5優(yōu)勢等位基因為T，優(yōu)勢基因型為TT； SNP6優(yōu)勢等位基因為G，優(yōu)勢基因型為GG； SNP7優(yōu)勢等位基因為A，優(yōu)勢基因型為AT；SNP8優(yōu)勢等位基因為G，優(yōu)勢基因型為GG。根據(jù)多態(tài)信息含量PIC的分類，SNP5和SNP7屬于中度多態(tài)(0.250.05)，其余各突變位點均呈現(xiàn)Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)(P<0.05)。表2

表2 COMT 基因第1外顯子SNPs分析

Table 2 The genotype frequency, allele frequency and genetic diversity of SNP sites of COMT gene exon1

基因型頻率(%)Genotypic frequency等位基因頻率/%Allelic frequencyPICHeNeH-W P值H-W P valueSNP1AAACCCAC85.712.8611.4387.1412.860.200 00.224 11.288 83.99E-07SNP2GGGAAAGA88.57011.4388.5711.430.182 00.202 41.253 86.05E-09SNP3CCCAAACA88.572.868.570.90.10.16380.180 01.219 51.43E-06SNP4AAAGGGAG85.712.8611.4387.1412.860.199 00.224 11.288 83.99E-07SNP5TTTAAATA62.8614.2822.8670300.331 80.420 01.724 10.000 1SNP6GGGAAAGA88.5711.43094.295.710.102 00.107 81.120 81.000 0SNP7AAATTTAT28.5757.1414.2957.1442.860.369 80.489 81.960 00.364 7SNP8GGGAAAGA80.0014.295.7187.1412.860.199 00.224 11.288 80.056 0

2.3 連鎖不平衡

通過Haploview 4.2軟件構建伊犁馬COMT第1外顯子的連鎖不平衡圖譜，并進行連鎖不平衡分析，研究表明，在試驗樣本中，各突變位點中存在較多的連鎖，其中SNP1和SNP4完全連鎖，SNP1和SNP2、SNP3、SNP5、SNP6，SNP2和SNP3、SNP4、SNP6，SNP3和SNP4、SNP8，SNP4和SNP5、SNP6，SNP6和SNP8間存在強的連鎖不平衡(D’>0.75， r2>0.33)，其余各突變位點間連鎖關系相對較弱。圖1，表3

圖1 連鎖不平衡

Fig.1Linkagedisequilibriumanalysis

表3 COMT基因第1外顯子基因多態(tài)位點配對連鎖不平衡

Table 3 Analysis of pairwise linkage disequilibrium in COMT gene exon1

位點SiteSNP1SNP2SNP3SNP4SNP5SNP6SNP7SNP8SNP11.0001.0001.0001.0001.0001.0000.744SNP20.8750.8391.0001.0001.0001.0000.713SNP30.7530.6061.0001.0000.7221.0000.835SNP41.0000.8750.7531.0001.0001.0000.744SNP50.3440.3010.2590.3441.0000.7260.841SNP60.4110.470.2850.4110.1411.0001.000SNP70.1970.1720.1480.1970.3010.0811.000SNP80.5530.4450.5250.5530.2440.4110.197

注：對角線右上方為D’，左下方為r2

Note： D’ are above the diagonal for SNPs. r2are below the diagonal for SNPs

2.4 單倍型構建

通過Haploview 4.2軟件對各突變位點進行單倍型構建，在試驗樣本中，COMT基因第1外顯子共構建9種單倍型，各單倍型頻率位于1.40%～52.30%，其中優(yōu)勢單倍型為H1(AGCATGAG)。通過對突變位點進行比對，在試驗樣本中，共發(fā)現(xiàn)8種單倍型組合，各單倍型組合頻率位于2.86%～31.43%，其中優(yōu)勢單倍型組合為H1H2。表4，表5

表4 COMT基因第1外顯子單倍型頻率

Table 4 Haplotype frequencies within the COMT gene exon1

單倍型HaplotypeH1H2H3H4H5H6H7H8H9序列 SequenceAGCATGAGAGCATGTGAGCAAGTGCAAGAGTACAAGAATAAGCAAGAGAGCAAGAAAGCATGTACGAGAGTA頻率 Frequency52.30%16.30%12.30%3.60%3.60%3.40%1.40%1.40%1.40%

表5 COMT基因第1外顯子單倍型組合頻率

Table 5 Diplotype frequencies within the COMT gene exon1

單倍型組合DiplotypeH1H1H1H2H1H3H1H8H3H6H3H7H3H9H4H5頻數(shù) Absolute frequency1011512112頻率 Frequency28.57%31.43%14.29%2.86%5.71%2.86%2.86%5.71%

2.5 SNPs位點及單倍型組合與心率的關聯(lián)

COMT基因第1外顯子SNPs位點與馬匹靜息心率、溫和刺激心率及劇烈刺激心率的關聯(lián)分析為，在SNP1和SNP4中，AA型、AC(AG)型和CC(GG)型的三種心率差異均不顯著(P>0.05)；在SNP2中，AA型的劇烈刺激心率顯著性大于GG型(P<0.05)，其余兩種心率差異不顯著(P>0.05)；在SNP3中，AA型的溫和刺激心率極顯著性大于CC型(P<0.01)，其余兩種心率差異不顯著(P>0.05)；在SNP5中，AA型的溫和刺激心率和劇烈刺激心率均顯著性大于TA型(P<0.05)，TT與AA、TA之間差異性不顯著(P>0.05)；在SNP6中，GA型的劇烈刺激心率顯著性大于GG型(P<0.05)，其余兩種心率差異不顯著(P>0.05)；在SNP7中，TT型的劇烈刺激心率極顯著性大于AA型及AT型(P<0.01)，其余兩種心率差異不顯著(P>0.05)；在SNP8中，GA型的劇烈刺激心率極顯著性大于GG型(P<0.01)，其余兩種心率差異不顯著(P>0.05)。挑選樣本量相對較多(大于3個樣本)的COMT基因第1外顯子單倍型組合與馬匹靜息心率、溫和刺激心率及劇烈刺激心率進行關聯(lián)分析，結果顯示H1H2單倍型組合劇烈刺激心率顯著性大于H1H3單倍型組合(P<0.05)，H1H1單倍型組合與H1H2、H1H3單倍型組合劇烈刺激心率差異不顯著(P>0.05)，三種單倍型組合其余兩組心率間差異不顯著(P>0.05)。表6

表6 COMT基因第1外顯子SNPs位點及單倍型組合與心率的關聯(lián)

Table 6 Association between SNPs of COMT gene exon1and heart rate

靜息心率溫和刺激心率劇烈刺激心率SNP1AA(30)45.90±10.3459.10±14.5785.87±20.14AC(1)53.0057.00171.00CC(4)47.50±7.1468.00±11.63118.50±44.16SNP2AA(4)47.50±7.1468.00±11.63118.50±44.16aGG(31)46.13±10.2459.03±14.3388.61±25.01bSNP3AA(3)48.33±8.5073.67±3.21A102.33±36.83CA(1)53.0057.00171.00CC(31)45.87±10.1658.00±14.40B88.48±24.58SNP4AA(30)45.90±10.3459.10±14.5785.87±20.14AG(1)53.0057.00171.00GG(4)47.50±7.1468.00±11.63118.50±44.16SNP5AA(8)47.25±10.1469.13±19.55a107.63±45.13aTA(5)42.40±12.5656.60±11.33b71.40±12.95bTT(22)46.82±9.4357.55±11.56ab91.05±20.42abSNP6GA(4)47.50±7.1468.00±11.63118.50±44.16aGG(31)46.13±10.2459.03±14.3388.61±25.01bSNP7AA(10)48.20±8.9954.90±12.4888.90±14.11BAT(20)44.75±10.9861.20±15.3785.85±22.90BTT(5)48.60±6.6665.80±11.21129.00±44.87ASNP8AA(2)52.50±6.3672.50±3.5499.50±51.62ABGA(5)53.00±10.6568.40±15.84126.00±40.71AGG(28)44.64±9.5057.68±13.6385.43±20.54BH1H1(10)48.20±8.9954.90±12.4785.90±14.11abH1H2(11)44.00±8.5959.09±11.0494.55±25.30aH1H3(5)42.40±12.5656.60±11.3371.40±12.95b

注：同一基因型同列肩標不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異性顯著(P<0.05)

Note： Different capital and lowercase letters indicate significant difference of different genotypes of one same SNP site atP<0.01 andP<0.05 level, respectively

3 討 論

3.1 COMT基因第1外顯子多態(tài)性

COMT基因位于人類第22號染色體，家鼠第16號染色體，狗第26號染色體，馬第8號染色體。在基因編碼區(qū)導致多態(tài)性的眾多位點中，最受關注、研究最熱的位點是第158位氨基酸(VAL→Met)位點，該位點可導致COMT酶活性降低3～4倍[20]。在人和動物的研究上，還發(fā)現(xiàn)了一些其他位點的突變，并對相關性狀產生了一定的影響。在馬的研究上，Y. Momozawa等[21]對純血馬COMT基因多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)G217A、C219T、A780G、C823A四個多態(tài)性位點，其中(g.429258)G217A導致氨基酸從丙氨酸到蘇氨酸的改變，C219T同義突變，A780G、C823A為非編碼區(qū)突變。查干其其格等[22,23]對內蒙古五個品種的馬和純血馬 COMT 基因第二、四外顯子多態(tài)性進行檢測，發(fā)現(xiàn)存在突變位點。研究在COMT基因第1外顯子上共發(fā)現(xiàn)了8個SNPs，相關突變以前并未報道，同時在此次實驗樣本中沒有發(fā)現(xiàn)Y. Momozawa等[21]發(fā)現(xiàn)G217A、C219T兩個突變。形成這一現(xiàn)象可能是由于品種間差異所導致。

3.2 COMT基因第1外顯子多態(tài)性的遺傳變異

He、Ne和PIC等遺傳參數(shù)常用來評估群體的遺傳多樣性。此次試驗選取的樣本所檢測出突變位點中，SNP5和SNP7屬于中度多態(tài)，其余各SNP位點均屬于低度多態(tài)。同時，對各SNP位點的Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)進行分析，SNP6、SNP7、SNP8處于平衡狀態(tài)，其余各突變位點均呈現(xiàn)不平衡狀態(tài)，說明試驗所選取的樣本并不是一個理想型的群體。導致形成這一現(xiàn)象的原因可以解釋為：一、所選取樣本量相對偏少；二、伊犁馬屬于培育品種，其形成年限較短，僅幾十年，同時由于近年來伊犁馬改良過程中又引入外血馬的血液。對伊犁馬COMT第1外顯子突變進行連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)，在8個突變位點發(fā)現(xiàn)較多的強連鎖現(xiàn)象，其中SNP1和SNP4完全連鎖，這可能主要由此次試驗所發(fā)現(xiàn)的突變的位置離的較近所導致，尤其是SNP1～4表現(xiàn)尤為明顯。出現(xiàn)上述現(xiàn)象也說明伊犁馬性能仍然處于優(yōu)化過程中，其遺傳仍不穩(wěn)定，也就為伊犁馬分化為新的類型或品系提供了新的可能。

3.3 COMT基因第1外顯子對心率的影響

前人研究發(fā)現(xiàn)，將雄性鼠的純合COMT基因敲除，結果表現(xiàn)出進攻性行為加強，而對雌性鼠進行敲除，結果表現(xiàn)出情緒低落[24]；犬第四外顯子COMT不同基因型與分離焦慮的易感性有關[25]；蒙古馬COMT基因第二外顯子G217A突變顯著影響其競爭性行為[22]；綜上說明COMT基因對動物行為、氣質、性格等質量性狀存在較大的影響，但這些性狀往往不好量化，前人相關研究集中采用調查問卷等主觀形式。心率作為一個重要的生理指標，一定程度上反應了馬匹的氣質和行為，故試驗創(chuàng)新引入心率這個數(shù)量性狀進行分析，從數(shù)值上更能客觀的反應COMT的影響機制[26]。當條件性刺激后，COMT的Val載體能更快適應環(huán)境突發(fā)事件的變化，促進對突變環(huán)境認知的穩(wěn)定性[27]。此次的試驗中心率方面收集了靜息心率、溫和刺激心率和劇烈刺激心率3組數(shù)據(jù)，也充分考慮了外界刺激這一因素。試驗結果顯示不同基因型、不同單倍型組合的3組心率在劇烈刺激心率差異最為明顯，在溫和刺激心率中也存在一定的差異，而靜息心率中則沒有發(fā)現(xiàn)差異。就COMT第1外顯子不同基因型、不同單倍型組合在伊犁馬上如何調節(jié)兒茶酚胺、多巴胺等物質代謝，如何影響馬匹氣質、行為和性格，氣質、行為和性格等性狀如何影響心率等生理數(shù)據(jù)變化的機制仍需進一步研究。

4 結 論

伊犁馬COMT第1外顯子上存在多態(tài)性，共發(fā)現(xiàn)8個突變位點，其中SNP1、SNP2、SNP4、SNP5、SNP7和SNP8為錯意突變，SNP3為無義突變，SNP6為同義突變。不同突變間存在一定程度的強連鎖，除SNP7與其余各突變間均無較強連鎖外，SNP1-6、SNP8均存在一定的強連鎖關系，SNP1和SNP4完全連鎖。構建出9種單倍型，其中H1位優(yōu)勢單倍型，此次采集樣本共形成8種單倍型組合，其中H1H2為優(yōu)勢單倍型組合。不同基因型、單倍型組合個體在心率上存在一定程度的差異，COMT基因可能是對伊犁馬氣質和生產性能影響的重要功能基因。