陸亞冬，劉賢俠，陳創(chuàng)夫

(石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832003)

0 引 言

【研究意義】牛冠狀病毒(Bovine Coronavirus，BCV)系冠狀病毒科冠狀病毒屬成員，其感染對(duì)象是脊椎動(dòng)物，常常是引起10日齡以下初生犢牛腹瀉，由牛冠狀病毒引起的牛冠狀病毒病，是一種以胃腸炎為主要癥狀的，高度接觸性傳染病，經(jīng)口感染為主，其傳染源主要是腹瀉犢牛的糞便被健康犢牛舔食，引起初生犢牛腹瀉，治愈率低，目前尚無(wú)有效的治療藥物和疫苗，對(duì)小腸絨毛上皮的損害十分嚴(yán)重[1]，抗原性方面牛冠狀病毒和其他冠狀病毒之間具有部分交叉性。冠狀病毒很容易產(chǎn)生變異，自身不穩(wěn)定，診斷和預(yù)防該病很困難?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前尚無(wú)有效的治療藥物和疫苗，牛冠狀病毒對(duì)小腸絨毛上皮的損害十分嚴(yán)重[1]，抗原性方面牛冠狀病毒和其他冠狀病毒之間具有部分交叉性。冠狀病毒很容易產(chǎn)生變異，自身不穩(wěn)定，診斷和預(yù)防該病很困難。目前常規(guī)檢測(cè)方法不適合臨床的大規(guī)模應(yīng)用，費(fèi)用高?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】應(yīng)用PCR和ELISA方法對(duì)新疆部分地區(qū)規(guī)?；?chǎng)進(jìn)行致犢牛腹瀉冠狀病毒病的初步調(diào)查，應(yīng)用原核表達(dá)蛋白純化技術(shù)對(duì)牛冠狀病毒核衣殼蛋白進(jìn)行初步研究，核衣殼蛋白是牛冠狀病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白，常作為檢測(cè)抗原，在病毒侵染宿主方面起著扮演著重要的角色，可作為診斷牛冠狀病毒病的候選蛋白?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】牛冠狀病毒N 基因表達(dá)的N蛋白比較保守，既可以作為冠狀病毒病的診斷方面用的抗原，又具有很強(qiáng)的免疫原性[2]。研究建立一種快速診斷的試劑盒或試紙條奠定一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

E.coliDH 5α菌株、BL21(DE3)菌株和原核表達(dá)載體PET-28a、PET-32a菌株均由石河子大學(xué)動(dòng)物疾病防控兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；PMD19-T載體購(gòu)自寶生物(大連)公司。

牛冠狀狀病毒陽(yáng)性病料采自新疆部分規(guī)?；?chǎng)；IPTG購(gòu)自MerK公司；限制性內(nèi)切酶(EcoRI/HindIII)、T4連接酶、DNA Marker購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；質(zhì)粒小提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、HRP標(biāo)記的山羊抗牛IgG、廣譜彩虹預(yù)染Marker，His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(包涵體蛋白)，His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(包涵體蛋白)購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限責(zé)任公司；牛冠狀病毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清購(gòu)自青島瑞爾公司；牛冠狀病毒陽(yáng)性血清采集自新疆北疆地區(qū)部分發(fā)病犢牛規(guī)?；瘓?chǎng)，經(jīng)牛冠狀病毒抗原檢測(cè)ELISA試劑盒鑒定。

1.2 方 法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)及合成

采集石河子周邊、沙灣、奎屯等部分地區(qū)規(guī)模化牛場(chǎng)腹瀉犢牛糞便樣品141份，健康犢牛糞便若干份。所采集的腹瀉犢牛病程大多在10日齡以內(nèi)。根據(jù)GenBanK中(登錄號(hào)：318090.1)Mebus株N基因保守序列設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物，擴(kuò)增牛冠狀病毒部分基因的引物，同時(shí)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行原核表達(dá)，上游引物含有EcoRΙ位點(diǎn)，下游引物含有HindⅢ位點(diǎn)，引物由上海生物工程股份有限公司合成。表1，表2

表1 牛冠狀病毒部分基因引物信息

Table 1 Partial gene primer information of bovine coronavirus

名稱Name引物序列(5’-3’)Primer sequence (5 '-3')擴(kuò)增大小Amplification size (bp)退火溫度TmBCV-N-F1CGGGATCCATGTCTTTTACTCCTGGTBCV-N-F2CCGCTCGAGTTATATTTCTGAGGTGT1 34758℃BCV FATACCCCGGCTGACATTCTCGBCV RCTCTTCTGGCGGGGCTTATTCA 35555℃

表2 PCR引物序列

Table 2 Nucleotide sequences of PCR primers

引物名稱Primer name序列(5’-3’)Sequence (5 '-3')擴(kuò)增長(zhǎng)度Amplification length (bp)退火溫度TmBCV -N-FCGAATTCATGTCTTTTACTCCTGGTAAGCABCV -N-RCCAAGCTTTTATATTTCTGAGGTATCTTCAGTAAAGG1 40058℃

1.2.2 牛冠狀病毒抗原ELISA檢測(cè)

(1)試劑準(zhǔn)備：按照說(shuō)明書操作，使用前所有試劑恢復(fù)至室溫。

(2)操作步驟：按照牛冠狀病毒抗原ELISA說(shuō)明書進(jìn)行，試劑盒原理是雙抗體夾心法，將處理好的樣品上清液吸取200 μL加入已經(jīng)預(yù)先包被牛冠狀病毒捕獲抗體的微孔中，同時(shí)設(shè)置陰陽(yáng)性對(duì)照孔和空白孔，除空白孔外，樣品孔中加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μL，微量震蕩儀器上進(jìn)行震蕩混勻，用封板膜封好后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中作用1 h，取出棄掉微孔中的液體，每孔用洗滌液洗板5次，每次2 min，加入底物后避光孵育15 min，用終止液進(jìn)行終止，在450 nm的酶標(biāo)儀上進(jìn)行讀數(shù)。

1.2.3 牛冠狀病毒 N基因的擴(kuò)增、克隆、測(cè)序及鑒定

用Trizol法提取牛冠狀病毒病料的RNA，以此為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。采用25 μL反應(yīng)體系：ddH2O 9.7 μL、上下游引物各0.4 μL、模板2.0、2×EsTaqMasterMiX 12.5 μL空白對(duì)照：模板改為水。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 5 min，變性94℃ 40 s，退火64℃ 30 s，延伸72℃ 2 min，重復(fù)30個(gè)循環(huán)，再延伸 72℃ 10 min，4℃保存。擴(kuò)增后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切膠回收。將N基因PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體相連，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞。篩選陽(yáng)性克隆，小提質(zhì)粒并進(jìn)行EcoRΙ/HindⅢ雙酶切，獲得目的基因片段，切割膠回收N DNA片段和PET-28a和PET-32a酶切產(chǎn)物。將回收的N基因片段與表達(dá)載體PET-28a和PET-32a于16℃連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂于培養(yǎng)基板上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)16～18 h，選取生長(zhǎng)良好的轉(zhuǎn)化菌落，進(jìn)行篩選后提取PET -28a-N質(zhì)粒和PET-32a-N質(zhì)粒，并將篩選后經(jīng)雙酶切鑒定目的條帶正確的質(zhì)粒送上海生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果用DNAMAN軟件進(jìn)行在線比對(duì)，并將其轉(zhuǎn)化入BL(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂于含有卡那霉素(PET-28a-N)的培養(yǎng)基板上和氨芐霉素(PET-32a-N)的培養(yǎng)板上。37℃過(guò)夜培養(yǎng)16～18 h，選取生長(zhǎng)良好的轉(zhuǎn)化菌落，進(jìn)行篩選。經(jīng)酶切鑒定后重組表達(dá)載體命名為PET-28a-N和PET-32a-N。

1.2.4 牛冠狀病毒 N基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

將陽(yáng)性克隆菌接種到含有抗性(100 mg/L)LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 220 r/min搖菌過(guò)夜。吸取200 μL菌液接種到20 mL含有抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)至菌液旺盛期，加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，分別于2、4、6、8 h取樣。同時(shí)設(shè)空載體和未加IPTG誘導(dǎo)的重組菌作為對(duì)照。

1.2.5 重組蛋白BCV-28a-N-DE3和BCV-32a-N-DE3的上清/包涵體鑒定及純化

經(jīng)SDS-PAGE鑒定條帶正確的重組蛋白BCV-28a-N-DE3和BCV-32a-N-DE3，分別用2 L的三角瓶進(jìn)行批量誘導(dǎo)后進(jìn)行收菌，加入適量的裂解液進(jìn)行過(guò)夜裂解，裂解菌體之后，取1 mL菌液分裝到1.5 mL離心管中， 8 000 r/m離心30 min，分別取上清和沉淀，進(jìn)行15%SDS-PAGE進(jìn)行電泳，鑒定上清和沉淀。重組蛋白的純化采用His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(包涵體蛋白)、His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(可溶性蛋白)主要操作步驟：

緩沖液的準(zhǔn)備

包涵體蛋白純化緩沖液配方。表3

表3 包涵體蛋白純化緩沖液配方

Table 3 Formulation of inclusion body protein purification buffer

組分ComponentTris-HCl(pH7.9)ImidazoleNaClUreaBinding Buffer20 mM5 mM0.5M8MElution Buffer20 mM500 mM0.5M8M

組裝層析柱，將Ni-Agarose Resin填料混勻后加入層析柱，室溫靜置10 min，待凝膠與溶液分層后，把底部的出液口打開，讓乙醇通過(guò)重力作用緩慢流出．向裝填好的柱中加入5倍柱體積的去離子水將乙醇沖洗干凈后，再用8倍柱體積的 Binding Buffer平衡柱子，平衡結(jié)束后即可上樣。包涵體蛋白的純化，收集菌體后，每100 mg菌體(濕重)加入2 mL 8 M尿素進(jìn)行變性，過(guò)夜裂解，超聲裂解菌體。10 000×g，4℃離心15 min，分離上清和沉淀，并收集沉淀，將沉淀重懸于Binding Buffer中，盡量混勻使包涵體充分溶解。10 000×g離心20 min，收集上清。將離心后的上清以孔徑為0.45 μm的濾膜過(guò)濾。將上清負(fù)載上柱，流速為10倍柱體積/h，收集流穿液。使用15倍柱體積的Binding Buffer沖洗柱子，洗去雜蛋白。使用適量Elution Buffer洗脫，收集洗脫峰。洗脫后，依次使用5倍柱體積的Binding Buffer，5倍柱體積的去離子水洗滌柱子，再用3倍柱體積的20%乙醇平衡(乙醇要將填料浸沒(méi))，封柱后2～8℃保存。

包涵體形式得到的蛋白需要進(jìn)行復(fù)性即在8M尿素變性后得到的變性條件下目的蛋白需要復(fù)性，將目的蛋白放到透析帶中，進(jìn)行梯度透析分別是6M尿素透析、4M尿素透析、2M尿素透析、1M尿素透析和去離子水透析，時(shí)間分別是6～8 h，最后用蔗糖吸干，分裝保存。

His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(可溶性蛋白)主要操作步驟。表4

表4 可溶性蛋白純化緩沖液配方

Table 4 Formula for soluble protein purification buffer

組分ComponentTris-HCl(pH7.9)ImidazoleNaClBinding Buffer20 mM10 mM0.5MElution Buffer20 mM500 mM0.5M

組裝層析柱：將Ni-Agarose Resin填料混勻后加入層析柱，室溫靜置10 min，待凝膠與溶液分層后，把底部的出液口打開，讓乙醇通過(guò)重力作用緩慢流出。填料的上層是乙醇保護(hù)層，將填料和乙醇一起混勻，以1 mL填料純化20～30 mg His標(biāo)簽蛋白計(jì)算，取需要的填料與乙醇的混合液加入層析柱。如果乙醇不流出，可以給柱子一個(gè)外力，用大拇指對(duì)柱口輕輕按壓一下，迫使乙醇流出。向裝填好的柱中加入5倍柱體積的去離子水將乙醇沖洗干凈后，再用10倍柱體積的Binding Buffer平衡柱子，平衡結(jié)束后即可上樣?？扇苄缘鞍椎募兓占w后，每100 mg菌體濕重加入1～5 mL細(xì)菌裂解液，每1 mL細(xì)菌抽提試劑中已加入10 μL蛋白酶抑制劑混合物，超聲裂解菌體。超聲過(guò)程中保持菌液處于冰浴中，超聲條件依賴于所使用的超聲儀功率，探頭種類，容器的大小形狀，需實(shí)驗(yàn)中自己摸索，應(yīng)避免連續(xù)超聲導(dǎo)致的大量產(chǎn)熱，可分成短時(shí)間，多次超聲，通過(guò)一定的間隔時(shí)間避免溶液過(guò)熱。最終菌液變清即可，10 000 r/m，4℃離心3 min，收集上清中的可溶性蛋白。用Binding Buffer將菌體裂解液等倍稀釋后負(fù)載上柱，流速為10倍柱體積/h，收集流穿液。使用15倍柱體積的Soluble Binding Buffer沖洗柱子，洗去雜蛋白。使用適量Soluble Elution Buffer洗脫，收集洗脫峰。洗脫后，依次使用10倍柱體積的去離子水洗滌柱子，再用3倍柱體積的20%乙醇平衡乙醇要將填料浸沒(méi)，封柱后2～8℃保存。

可溶性蛋白和包涵體蛋白純化方式主要是確定Bingding Buffer(組分Tris-HCl、immdazol、NaCl)和Elution Buffer(組分Tris-HCl、immdazol、NaCl)的中的咪唑的濃度，使用梯度咪唑濃度洗脫蛋白，通過(guò)SDS-PAGE和Western Blot檢測(cè)目的蛋白的純度和活性。

1.2.6 重組蛋白BCV-28a-N-DE3和BCV-32a-N-DE3的Western blot分析

將收集的菌液，10 000 r/min離心1 min 后棄去上清，加入20 μL 5×上樣緩沖液和80 μL去離子水懸浮菌體煮沸10 min，進(jìn)行SDS- PAGE電泳。用考馬斯亮藍(lán)染色鑒定牛冠狀病毒N蛋白的表達(dá)。使用半干式轉(zhuǎn)膜儀，將SDS-PAGE凝膠上的蛋白樣品轉(zhuǎn)印到0.45 μm NC 膜上(300 mA，50 min)，用Western blot膜封閉液封閉1 h,TBST洗滌3次，每次5 min，加入稀釋的牛冠狀病毒陽(yáng)性血清，37℃孵育2 h,TBST 洗滌3～5次，每次5～10 min，加入1∶4 900稀釋的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗牛IgG，孵育2 h，TBST洗滌3～5次，每次5～10 min ，加入DAB顯色液進(jìn)行顯色反應(yīng)，于顯色完成后用水終止。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR檢測(cè)牛冠狀病毒

應(yīng)用PCR方法對(duì)新疆部分地區(qū)主要規(guī)?；?chǎng)腹瀉犢牛糞便樣品141份，陽(yáng)性份數(shù)87份，總陽(yáng)性率：61.7%，擴(kuò)增出預(yù)期的目的片段大小，進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示N基因的序列與標(biāo)準(zhǔn)序列同源性達(dá)到98.22%，同源性較高，說(shuō)明檢測(cè)的犢牛樣品中含有冠狀病毒。

牛冠狀病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白基因是N基因，N基因高度保守,可作為診斷BCV的候選基因。PCR檢測(cè)結(jié)果表明新疆部分地區(qū)腹瀉犢牛遭受冠狀病毒感染。圖1，圖2，表5

表5 新疆部分地區(qū)主要規(guī)?；?chǎng)腹瀉犢牛糞便樣品RT-PCR陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果

Table 5 The main part of Xinjiang area scale test results positive fecal samples of RT-PCR cattle calf diarrhea

主要規(guī)?；?chǎng)Major scale cattle farm樣品總數(shù)Number of samples陽(yáng)性份數(shù)Positive number陽(yáng)性率Positive rate (%)石河子某A規(guī)?；?chǎng)12650.00沙灣縣某A規(guī)模化奶牛場(chǎng)111090.90沙灣某B規(guī)?；?chǎng)16743.75沙灣某C規(guī)模化牛場(chǎng)10550.00奎屯某A規(guī)?；?chǎng)232295.65奎屯某B規(guī)?；?chǎng)8675.00奎屯某C規(guī)?；?chǎng)8450.00奎屯某D規(guī)?；?chǎng)9888.88奎屯某E規(guī)模化牛場(chǎng)11545.45奎屯某F規(guī)?；?chǎng)1218.30奎屯某G規(guī)?；?chǎng)11763.63沙灣某B規(guī)?；?chǎng)10660.00總計(jì)1418761.70

注：*上述健康犢牛血清采集石河子某試驗(yàn)站

Note：

注：M:Maker；12：陰性對(duì)照；1～4、8未擴(kuò)增出牛冠狀病毒基因；5～7、9～11：牛冠狀病毒N基因克隆產(chǎn)物

Note： M:Maker; 12: negative control; 1-4 and 8 did not amplify the coronavirus gene; 5-7, 9-11: Bovine coronavirus N gene clone product

圖1 某A規(guī)?；?chǎng)腹瀉犢牛糞便冠狀病毒基因擴(kuò)增

Fig.1 A scale cattle feces of calves diarrhea coronavirus gene amplification detection results

注：M:Maker；19：陰性對(duì)照；1～18、20～24：均擴(kuò)增出牛冠狀病毒N基因部分基因355 bp

Note： M:Maker; 19: Negative control; 1-18, 20-24: All the N genes of bovine coronavirus were amplified by partial 355 bp gene

圖2 某B規(guī)?；?chǎng)牛場(chǎng)腹瀉犢牛糞便樣品冠狀病毒基因擴(kuò)增

Fig.2 B large-scale dairy cattle calves fecal samples of diarrhea coronavirus gene amplification detection results

2.2 ELISA檢測(cè)

(1)檢測(cè)新疆部分地區(qū)主要規(guī)?；?chǎng)腹瀉犢牛樣品 141份，陽(yáng)性數(shù)99份，陽(yáng)性率70.21%。表6

2.3 牛冠狀病毒N基因的擴(kuò)增

用BCV- N-F/BCV- N-R引物擴(kuò)增N基因，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)到約1 400 bp條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。圖3

表6 新疆部分地區(qū)主要規(guī)?；?chǎng)腹瀉犢牛糞便樣品雙抗體夾心法ELISA陽(yáng)性檢測(cè)

Table 6 The main part of the Xinjiang scale of dairy calves diarrhea stool samples of double antibody sandwich ELISA positive test results

主要規(guī)?；?chǎng)Major scale cattle farm樣品數(shù)Number of samples陽(yáng)性數(shù)Positive number陽(yáng)性率Positive rate (%)石河子某A規(guī)?；?chǎng)121083.33沙灣縣某A規(guī)?；膛?chǎng)11981.81沙灣某B規(guī)?；?chǎng)161487.50沙灣某C規(guī)?；?chǎng)10880.00奎屯某A規(guī)?；?chǎng)232191.30奎屯某B規(guī)模化牛場(chǎng)8225.00奎屯某C規(guī)?；?chǎng)8562.50奎屯某D規(guī)?；?chǎng)9444.00奎屯某E規(guī)?；?chǎng)111090.90奎屯某F規(guī)?；?chǎng)12216.66奎屯某G規(guī)?；?chǎng)11981.00沙灣某B規(guī)?；?chǎng)10550.00總計(jì)1419970.21

注：健康犢牛血清采集自石河子某實(shí)驗(yàn)站

注：M:DNA 標(biāo)準(zhǔn)MarKer 5 000;1、3：N基因產(chǎn)物；2：陰性對(duì)照

Note： M:DNA standard MarKer 5,000; 1, 3:N gene products; 2: Negative control

圖3 N基因的擴(kuò)增結(jié)果

Fig.3 The amplification result of N gene

2.4 鑒定重組克隆載體PMD 19-T-N

分別采用雙酶切法鑒定重組質(zhì)粒PMD19-T-N,用EcoRΙ/HindⅢ酶切片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)到約1 400 bp片段和約4 000 bp處可見清晰條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。圖4

2.5重組原核表達(dá)載體PMD19-T-28a-N和PMD19-T-32a-N的雙酶切及測(cè)序結(jié)果鑒定

將PMD19-T-28a-N 用EcoRΙ/HindⅢ雙酶切鑒定，以2.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果分別在1 400 bp和5 369 bp出可見清晰條帶(圖5)和(圖6)，同時(shí)將保守序列測(cè)序結(jié)果與牛冠狀病毒N基因標(biāo)準(zhǔn)毒株Mebus株基因序列應(yīng)用DNAMAN軟件進(jìn)行在線比對(duì)同源性達(dá)到98.22%(部分測(cè)序結(jié)果圖7)。圖5～7

注：M：DNA 標(biāo)準(zhǔn)MarKer 5 000 bp.1、2、3、4、5雙酶切后的目的條帶；6：未進(jìn)行雙酶切的PMD19-T-N質(zhì)粒

Note： M:DNA MarKer 5,000 bp.1, 2, 3, 4, 5 after double digestion to strip; 6: NO PMD19-T-N plasmid double digestion

圖4 PMD19-T-N 酶切鑒定結(jié)果

Fig.4 Enzyme digestion of PMD19-T -N

2.6 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE檢測(cè)

重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE經(jīng)分析表明，目的蛋白成功表達(dá)，重組蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約為54KD，與理論分析值相符。圖8

2.6.1 重組BCV-N-28a-DE3蛋白上清或包涵體的鑒定(圖9)

注：M：5 000 bp Maker.1、2、3：雙酶切后的目的條帶；4：未進(jìn)行雙酶切的陰性對(duì)照

Note： M:5,000 bp Maker.1, 2, 3: Target bands after double enzyme digestion; 4: Negative control without double enzyme digestion

圖5 PMD19-T-28a-N 酶切鑒定

Fig.5 Enzyme digestion of PMD19-T-28a-N

注：M：5 000 bp Maker.1、2：雙酶切后的目的條帶；3：未進(jìn)行雙酶切的陰性對(duì)照

Note： M:5,000 bp Maker.1, 2: Target bands after double enzyme digestion; 3: Negative control without double enzyme digestion

圖6 PMD19-T-32a-N 酶切鑒定

Fig.6 Enzyme digestion of PMD19-T-32a-N

圖7 牛冠狀病毒N基因保守序列測(cè)序結(jié)果部分

Fig.7 Sequence map of N gene of bovine coronavirus

注：M:蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。1、2、3、4加IPTG誘導(dǎo)的重組菌；5:PMD19-T-28a-N未誘導(dǎo)對(duì)照

Note： The molecular weight standard of M: protein. 1, 2, 3, 4 and IPTG induced recombinant bacteria; 5:PMD19-T-28a-N was not induced

圖8 重組蛋白 PMD19-T-28a-DE3-N SDS-PAGE分析

Fig.8 SDS-PAGE analysis of recombinant protein of PMD19-T-28a-DE3-NSDS-PAGE

注：2～6為蛋白表達(dá)在上清，1、7～9為蛋白表達(dá)在包涵體

Note： Description: 2-6 protein was expressed in supernatant, 1 and 7-9 were expressed in inclusion bodies

圖9重組BCV-N-28a-DE3蛋白上清或包涵體的鑒定

Fig.9 Identification of recombinantBCV-N-28a-DE3proteinsupernatantorinclusionbody

2.6.2 BCV-N-32a-DE3蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE鑒定

對(duì)加入誘導(dǎo)劑的菌進(jìn)行不同時(shí)間段收菌，同時(shí)設(shè)置未加誘導(dǎo)劑的作為對(duì)照，經(jīng)SDS-PAGE進(jìn)行蛋白表達(dá)及表達(dá)量的鑒定。圖10

注：M:蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～4:32a-N誘導(dǎo)2、4、6、8 h; 5:32a-N未誘導(dǎo)；6～7:32a-DE3未誘導(dǎo)

Note： M: Protein molecular quality standard; 1-4:32a-N induced 2, 4, 6, and 8h.5:32a-N did not induce; 6-7:32a-DE3 was not induced

圖10 BCV-N-32a-DE3蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE鑒定

Fig.10InducibleexpressionofBCV-N-32a-DE3proteinandidentificationofSDS-PAGE

2.6.3 BCV-N-32a-DE3蛋白表達(dá)的上清或包涵體鑒定(圖11)

注：M:廣譜彩虹預(yù)染Maker; 說(shuō)明：1～7為包涵體表達(dá)，9～11為上清表達(dá)

Note： M: Broad-spectrum rainbow pre staining Maker; Description: 1-7 For inclusion body expression, 9-11 For supernatant expression

圖11 BCV-N-32a-DE3蛋白表達(dá)的上清或包涵體鑒定

Fig.11 Identification of the supernatant or inclusion body of the expressionofBCV-N-32a-DE3protein

2.6.4 BCV-N-28a-DE3表達(dá)的蛋白純化結(jié)果

目的蛋白純化后目的蛋白的大小與理論值相符約54 KD。圖12

注：M:廣譜彩虹預(yù)染Maker;1：對(duì)照；2～4為500 mmoL咪唑洗脫下蛋白純化的結(jié)果

Note： M: Broad-spectrum rainbow pretreated Maker; 1: Contrast; 2-4 purified by 500mmol imidazole eluted protein

圖12重組表達(dá)蛋白BCV-N-28a-DE3表達(dá)的蛋白純化

Fig.12 Protein purification of recombinantexpressionproteinBCV-N-28a-DE3

2.6.5 BCV-N-32a-DE3表達(dá)的蛋白純化結(jié)果

全菌采用50 mM Tris-HCL(pH=7.9)，300 mM NaCl，50 mM Imidazole含1%的TritonX-100，1 mM DTT，1 mMPMSF超聲裂解，同時(shí)以50 mM Tris-HCL(pH=7.9)，300 mM NaCl，50 mM Imidazole平衡Ni柱之后用250 mmol、500 mmol咪唑的平衡緩沖液洗脫目的蛋白，并收集每個(gè)洗脫組分,整個(gè)過(guò)程在低溫下操作，進(jìn)行SDS-PAGE分析檢測(cè)。圖13，圖14

注：M：廣譜彩虹預(yù)染Marker,2～6為250 mmoL咪唑洗脫下目的蛋白純化的結(jié)果

Note： M: Broad spectrum rainbow pre dye Marker, 2-6 Purified result of 250mmol imidazole eluted target protein

圖13重組表達(dá)蛋白BCV-N-32a-DE3表達(dá)的蛋白純化

Fig.13 Protein purification of recombinantexpressionproteinBCV-N-32a-DE3

注：M：廣譜彩虹預(yù)染Marker，1～4、5～12、17～21為500 mmoL咪唑洗脫下目的蛋白純化的結(jié)果

Note： M: Broad-spectrum rainbow pre dye Marker, 1-4, 5-12, 17-21 for 500mmol imidazole eluted target protein purification results

圖14重組表達(dá)蛋白BCV-N-32a-DE3表達(dá)的蛋白純化

Fig.14 Protein purification of recombinantexpressionproteinBCV-N-32a-DE3

2.7牛冠狀病毒重組表達(dá)BCV-N-28a-DE3和BCV-N-32a-DE3的Western blot鑒定

重組菌表達(dá)產(chǎn)物通過(guò)Western blot進(jìn)行分析。其結(jié)果顯示，在54 KD處有明顯條帶，與預(yù)期值相符，在70 KD處有明顯條帶，同樣與預(yù)期值相符Western blot分析結(jié)果表明，表達(dá)的重組N蛋白可以與牛冠狀病毒陽(yáng)性血清發(fā)生特異性免疫學(xué)反應(yīng)，證實(shí)表達(dá)的重組N蛋白具有良好的反應(yīng)原性。圖15，圖16

2.7.1 重組表達(dá) BCV-N-28a-DE3蛋白的Western blot的鑒定

注：M:蛋白質(zhì)分子標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量 Marker；1、2純化后的PMD19-T-28a-DE3-N 融合蛋白

Note： M: Protein molecular standard mass Marker; 1 and 2 purified PMD19-T-28a-DE3-N fusion protein

圖15 融合蛋白的Western blot分析

Fig.15 Western blot analysis of fusion protein

注：M:蛋白質(zhì)分子標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量 Marker；1～4：純化的重組蛋白N與牛冠狀病毒陽(yáng)性血清發(fā)生反應(yīng)(陽(yáng)性血清濃度：分別是1～2，1:100；3～4,1:50)。5～6：純化的重組蛋白N與牛陰性血清不發(fā)生反應(yīng)

Note： M: Protein quality standard Marker; 1-4: Recombinant protein N and Bovine coronavirus positive serum purified reaction (positive serum concentration were 1-2, 1:100; 3-4,1:50). 5-6: Purified recombinant protein N did not react with bovine negative serum

圖16 重組表達(dá)純化的蛋白BCV-N-28a-DE3Western blot分析

Fig.16 Recombinant expression and purificationofproteinBCV-N-28a-DE3Westernblotanalysis

注：M：蛋白質(zhì)分子標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量；1：純化的重組蛋白N與牛冠狀病毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清發(fā)生反應(yīng)

Note： M: Protein molecular standard quality; 1: Purified recombinant protein N reacted with bovine coronavirus standard positive sera; Analysis of recombinant expression and purification protein BCV-N-28a-DE3 Western blot

圖17 重組表達(dá)純化的蛋白BCV-N-28a-DE3Western blot分析

Fig.17 Recombinant expression andpurificationofproteinBCV-N-28a-DE3Westernblotanalysis

2.7.2 重組表達(dá) BCV-N-32a-DE3蛋白的Western blot的鑒定

注：M：蛋白質(zhì)分子標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量；1～5：重組蛋白N與牛冠狀病毒陽(yáng)性血清發(fā)生反應(yīng)

Note： M: Protein molecular standard quality; 1-5: Recombinant protein N reacts with bovine coronavirus positive serum

圖18重組表達(dá)BCV-N-32a-DE3蛋白的Western blot的鑒定

Fig.18 Identification of recombinant WesternblotexpressingBCV-N-32a-DE3protein

注：M:蛋白質(zhì)分子標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量 Marker;1～4：重組蛋白與牛冠狀病毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清發(fā)生反應(yīng)

Note： M: Protein molecular standard mass Marker; 1-4: Recombinant protein and Bovine coronavirus standard positive serum reaction

圖19重組表達(dá)BCV-N-32a-DE3蛋白的Western blot的鑒定

Fig.19 Identification of recombinant WesternblotexpressingBCV-N-32a-DE3protein

3 討 論

研究從新疆部分地區(qū)采集規(guī)模化牛場(chǎng)中采集腹瀉犢牛的糞便，對(duì)采集的糞便進(jìn)行恰當(dāng)?shù)奶幚恚瑧?yīng)用牛冠狀病毒抗原檢測(cè)試劑盒檢測(cè)新疆部分地區(qū)主要規(guī)?；?chǎng)腹瀉犢牛樣品 141份，陽(yáng)性數(shù)99份，陽(yáng)性率70.21%。應(yīng)用PCR方法對(duì)新疆部分地區(qū)主要規(guī)?；?chǎng)腹瀉犢牛糞便樣品141份，陽(yáng)性份數(shù)87份，總陽(yáng)性率為61.7%，綜合PCR方法和ELISA方法的檢出結(jié)果感染牛冠狀病毒腹瀉犢牛糞便陽(yáng)性率在61.7%～70.21%，這與張坤等[8]運(yùn)用PCR和ELISA方法對(duì)新疆北疆部分地區(qū)規(guī)?；?chǎng)冠狀病毒感染率略高，研究對(duì)新疆部分地區(qū)規(guī)?；?chǎng)腹瀉犢牛糞便中病原的調(diào)查具有一定的參考意義。

BCV是20世紀(jì)70年代初期發(fā)現(xiàn)的導(dǎo)致犢牛腹瀉病毒的主要病原之一，是引起新生犢牛出血性腹瀉,表現(xiàn)為急性大規(guī)模的爆發(fā)與流行，劇烈腹瀉，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、犢牛急劇消瘦、排噴射狀的糞便導(dǎo)致脫水嚴(yán)重、排黑色糞便中帶血，另有研究表明，犢牛腸道感染和呼吸道感染可能由同一型BCV引起的感染[3、4]。犢牛腹瀉病原有細(xì)菌、病毒、寄生蟲等均可導(dǎo)致犢牛腹瀉，給畜牧業(yè)造成了極大的損失。1972年Mebus等[5]在成年牛和犢牛的腹瀉物中通過(guò)電鏡法檢出BCV，1985年宋廣林等[6]、1990年姚火春等[7]對(duì)于冠狀病毒在我國(guó)的存在和流行進(jìn)行了研究。張坤等[8]進(jìn)行了牛冠狀病毒的分子流行病學(xué)調(diào)查，并繪制了系統(tǒng)發(fā)生樹，對(duì)核苷酸同源性的問(wèn)題作了介紹。

冠狀病毒是目前已知RNA病毒中最大的病毒，使得人和多種動(dòng)物易于感染，冠狀病毒基因組極易發(fā)生重組，在基因組的結(jié)構(gòu)特征方面牛冠狀病毒呈現(xiàn)遺傳的多樣性。N蛋白構(gòu)成牛冠狀病毒的核衣殼，是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，與病毒的致病性方面有關(guān)。喬軍等[9]研究表明N蛋白其結(jié)構(gòu)蛋白中保守性很高的蛋白，發(fā)現(xiàn)其N蛋白具有高度螺旋結(jié)構(gòu)，與Motokawa等[10]的研究一致。為了證明N蛋白在復(fù)制、翻譯、致病性等方面起作用，基于體外的復(fù)制實(shí)驗(yàn)，從RNA復(fù)制、加工中發(fā)現(xiàn)牛傳染性胃腸炎結(jié)構(gòu)蛋白N蛋白所制備的抗血清，在體外復(fù)制實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)能抑制90%的基因的合成。說(shuō)明N蛋白在致病性、復(fù)制及翻譯過(guò)程中起作用。N蛋白發(fā)現(xiàn)牛在感染該病毒早期，體內(nèi)就能產(chǎn)生抗蛋白的高水平抗體，N蛋白是病毒的主要免疫原蛋白之一，可誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答。在糖基化修飾，蛋白折疊的影響方面，冠狀病毒N蛋白的主要抗原表位，不受糖基化的修飾，蛋白折疊的影響，可應(yīng)用常規(guī)的原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，而且表達(dá)量很高，Seo和Seah等[11-12]、Peng 等[13]等分別對(duì)在研究雞傳染性支氣管炎病毒、嵌合小鼠肝炎病毒、豬傳染性胃腸炎病毒N蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)：N蛋白與CTL表位和B細(xì)胞表位，病毒的組織嗜性有關(guān)的區(qū)域及抗原位點(diǎn)有關(guān)。冠狀病毒的N蛋白是高度保守、抗原性和免疫原性比較強(qiáng)、N蛋白在BCV不同毒株間變異小并且在病毒RNA的包裝和復(fù)制中起重要作用的核衣殼蛋白，在病毒感染中可大量表達(dá)，核衣殼蛋白可作為病毒感染的靶抗原，具有重要的意義。由于冠狀病毒核衣殼蛋白N基因序列高度保守，可用于基因分型的鑒定。這與張婉琪等[14]利用同源性分析的研究發(fā)現(xiàn)N蛋白高度保守，而在不同屬冠狀病毒之間保守性很低且不完全一致。

4 結(jié) 論

4.1 應(yīng)用PCR和ELISA方法對(duì)新疆北疆部分地區(qū)規(guī)模化牛場(chǎng)中致犢牛腹瀉主要病原冠狀病毒進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)有較高的感染率，對(duì)規(guī)?；?chǎng)采取積極的防控提供依據(jù)。所采集141份腹瀉犢牛糞便中，用ELISA檢測(cè)陽(yáng)性率70.21%；再用PCR檢測(cè)出陽(yáng)性率為61.7%。犢牛冠狀病毒是導(dǎo)致石河子、沙灣、奎屯等10個(gè)規(guī)模化奶牛場(chǎng)和部分肉牛場(chǎng)犢牛腹瀉的主要病原；ELISA方法和PCR方法結(jié)合應(yīng)用檢測(cè)犢牛冠狀病毒效果具有參考意義。

4.2 在PET-28a和PET-32a原核表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)了BCV N蛋白，并進(jìn)行了免疫印跡實(shí)驗(yàn)，N蛋白具有很強(qiáng)的免疫反應(yīng)性。