師偉 高毅* 徐麗 王舒 王亞美 馬莉莉 陳小雪 張濤 曾令青

1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014 2. 山東省立醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250000 3. 山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250014

骨質(zhì)疏松是一種以骨量低下，骨微結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致骨脆性增加，易發(fā)生骨折為特征的全身性骨病。骨質(zhì)疏松屬于中醫(yī)“骨痿”、“骨痹”、“骨枯”范疇，中醫(yī)認(rèn)為“腎藏精，主骨、生髓”，腎虛是骨質(zhì)疏松癥的主要病機(jī)，治療上以補(bǔ)益肝腎為主。現(xiàn)代研究總結(jié)發(fā)現(xiàn)[1]，補(bǔ)腎類(lèi)中藥在提高骨密度、改善骨質(zhì)疏松癥狀、調(diào)節(jié)激素水平及骨代謝方面的作用療效顯著。

現(xiàn)選具有補(bǔ)腎作用的中藥鹿角補(bǔ)骨顆粒進(jìn)行研究。鹿角補(bǔ)骨顆粒為高毅教授治療骨質(zhì)疏松的臨床驗(yàn)方，療效確切，經(jīng)提取加工制成顆粒劑。鹿角補(bǔ)骨顆粒原名溫腎壯骨方，前期實(shí)驗(yàn)研究[2-4]已經(jīng)證實(shí)該方能夠緩解原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的臨床癥狀，起到預(yù)防骨量丟失的作用?，F(xiàn)對(duì)鹿角補(bǔ)骨顆粒對(duì)大鼠骨代謝及急性毒性進(jìn)行研究，檢測(cè)該方對(duì)大鼠骨代謝的影響及急性毒性，為臨床用藥療效性、安全性提供依據(jù)。

1 骨代謝實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與方法

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：5周齡wistar大白鼠60只，雌雄各半，體重110～120 g，購(gòu)于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司。動(dòng)物合格證號(hào)為：SCXK(魯)20140007(37009200003437)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑：大鼠血清Ⅰ型前膠原氨基末端前肽(PINP)試劑盒、骨鈣素(BGP)試劑盒、Ⅰ型膠原交聯(lián)羧基末端肽(CTX)試劑盒，北京冬歌生物科技有限公司。

1.1.3儀器設(shè)備：酶標(biāo)分析儀，安圖實(shí)驗(yàn)儀器(鄭州)有限公司。

1.1.4實(shí)驗(yàn)藥品：鹿角補(bǔ)骨顆粒用蒸餾水配成2.5 g/mL藥液備用，由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科提供。

1.1.5實(shí)驗(yàn)方法：將大鼠隨機(jī)分為三組，每組20只(雌雄各10只)，雌雄分開(kāi)，觀察一周，大鼠體重、進(jìn)食、糞便、活動(dòng)等情況均無(wú)異常，然后開(kāi)始灌胃給藥。每7天測(cè)一次體重，按體重變化調(diào)整給藥量，每天分1～2次灌胃給藥，每周給藥6 d，連續(xù)180 d，并觀察動(dòng)物活動(dòng)、毛色糞便、進(jìn)食體重變化等情況。用藥結(jié)束后，每組取14只大鼠(雌雄各半)，水合氯醛麻醉，進(jìn)行大鼠血清Ⅰ型前膠原氨基末端(PINP)、骨鈣素(BGP)、Ⅰ型膠原交聯(lián)羧基末端肽(CTX)含量檢測(cè)。進(jìn)行組間統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。高劑量組：按人用量40倍(92.0 g/kg)每天定時(shí)灌胃。低劑量組：按人用量10倍(23.0 g/kg)每天定時(shí)灌胃。對(duì)照組：按鼠重給等體積蒸餾水灌胃。

1.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

PINP：高劑量組和低劑量組含量均高于空白對(duì)照組(P<0.05)，且高劑量組高于低劑量組(P>0.05)；BGP：高劑量組和低劑量組含量均高于空白對(duì)照組(P>0.05)；CTX：高劑量組低于低劑量組(P>0.05)，高劑量組、低劑量組均高于空白組(P>0.05)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠骨代謝測(cè)定結(jié)果Table 1 Bone metabolic markers in each group

注：以下圖1、2、3分別為高劑量組，低劑量組，空白組。

Note： The following charts 1, 2, 3, respectively, high-dose group, low-dose group, blank group.

圖1 大鼠PINP測(cè)定結(jié)果，高劑量組大鼠血清PINP含量高于低劑量組，都高于空白組。Fig.1 The results of rat PINP assay showed that serum PINP level in the high-dose group was higher than those in the low-dose group, and both were higher than that in the blank group.

圖2 大鼠BGP測(cè)定結(jié)果：高劑量組大鼠血清BGP含量高于低劑量組，均高于空白組。Fig.2 The result of rat BGP showed that the content of BGP in the high dose group was higher than that in the low dose group, and both were higher than that in the blank group.

圖3 大鼠CTX測(cè)定結(jié)果：高劑量組大鼠血清CTX含量高于低劑量組，都高于空白組；隨著用藥劑量的增加，高劑量組大鼠血清CTX含量較低劑量組有下降趨勢(shì)。Fig.3 The results of CTX assay showed that the content of serum CTX in the high dose group was lower than that in the low dose group, but CTX in both dose groups was higher than that in the blank group. With the increase in dose, the CTX content in the high dose group decreased.

2 急性毒性實(shí)驗(yàn)

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)昆明種小白鼠50只，體重18～22 g，雌雄各半，購(gòu)于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(魯)20140007(37009200001685)。

2.2 實(shí)驗(yàn)藥物

鹿角膠補(bǔ)骨顆粒(由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科提供)，按常規(guī)煎藥方法煎煮，鹿角膠烊化，然后濃縮至1.94 g/mL,4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 方法

以一日內(nèi)最大耐受實(shí)驗(yàn)法，將40只小鼠，隨機(jī)分為兩組，每組20只，雌雄各半并分開(kāi)飼養(yǎng)，禁食12 h后，一組給鹿角膠補(bǔ)骨顆粒1.2 mL/20 g灌胃，另一組給同體積水，連續(xù)觀察七天。

2.4 結(jié)果

給藥后小鼠外觀毛色光亮，行為活動(dòng)正常，無(wú)異常病理性神經(jīng)反射出現(xiàn)，七天中進(jìn)食良好，無(wú)便稀，無(wú)血尿等其它異常表現(xiàn)，并無(wú)一死亡。體重變化與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異，見(jiàn)表2。

表2 急性毒性實(shí)驗(yàn)

3 討論

骨骼以骨重建的方式不斷進(jìn)行新陳代謝，骨重建由成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和骨細(xì)胞等組成的骨骼基本多細(xì)胞單位完成[5]。當(dāng)破骨細(xì)胞活性大于成骨細(xì)胞的活性時(shí)，骨溶解大于骨吸收，造成骨質(zhì)流失，進(jìn)而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生。骨基質(zhì)90%是由 I 型膠原組成，其合成與分解的代謝產(chǎn)物可間接反映骨轉(zhuǎn)換的情況。PINP 作為I型前膠原蛋白的兩種前肽之一，在血清中的含量反映成骨細(xì)胞合成骨膠原的能力，是反應(yīng)骨形成的重要標(biāo)志物[6-7]。CTX是由I 型膠原降解的產(chǎn)物，反應(yīng)了破骨細(xì)胞的活性，是骨吸收的重要指標(biāo)[7-8]。BGP主要由成骨細(xì)胞、成牙質(zhì)細(xì)胞和肥大軟骨細(xì)胞合成分泌，BGP是骨基質(zhì)中最重要的一種特異性非膠原蛋白，BGP產(chǎn)生后一部分吸收進(jìn)入骨基質(zhì)，另一部分釋放進(jìn)入外周血。其生理功能是調(diào)節(jié)和維持骨鈣，維持正常骨礦化，抑制異常羥基磷灰石結(jié)晶的形成。骨鈣素是評(píng)價(jià)骨形成和骨轉(zhuǎn)換率的特異性指標(biāo)[9-11]。

鹿角補(bǔ)骨顆粒由鹿角膠、熟地黃、骨碎補(bǔ)、淫羊藿、枸杞子、杜仲、當(dāng)歸、蛇床子、木香等組成。方中以鹿角膠、骨碎補(bǔ)為君藥，益精養(yǎng)血，溫補(bǔ)腎陽(yáng)，益精填髓的作用；淫羊藿、菟絲子、杜仲、熟地黃、白芍、枸杞子為臣藥，補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨，益精填髓同時(shí)發(fā)揮白芍養(yǎng)血柔肝、緩急止痛的功效。當(dāng)歸、木香、蛇床子為佐藥，溫腎壯陽(yáng)、養(yǎng)血行氣。諸藥合用，陰陽(yáng)并補(bǔ)，標(biāo)本兼施，補(bǔ)益陰精同時(shí)活血行氣，使補(bǔ)而不滯，協(xié)同作用，共奏補(bǔ)益肝腎，強(qiáng)筋壯骨的功效[4]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鹿角補(bǔ)骨顆粒能明顯提高大鼠PINP、BGP水平，隨劑量增加呈上升趨勢(shì)，說(shuō)明鹿角補(bǔ)骨顆粒能夠增加成骨細(xì)胞活性，促進(jìn)骨形成。鹿角補(bǔ)骨顆粒組大鼠CTX水平較空白組高，高劑量組較低劑量組降低，說(shuō)明隨服藥劑量增加，鹿角補(bǔ)骨顆粒一定程度上能降低破骨細(xì)胞活性，調(diào)節(jié)骨代謝，達(dá)到防治骨質(zhì)疏松的作用，并且急性毒性實(shí)驗(yàn)未見(jiàn)小鼠中毒表現(xiàn)。

本研究為鹿角補(bǔ)骨顆粒的療效性、安全性評(píng)價(jià)提供了科學(xué)依據(jù)，為鹿角補(bǔ)骨顆粒在臨床上進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)由于本實(shí)驗(yàn)未對(duì)大鼠進(jìn)行骨質(zhì)疏松造模，觀察時(shí)間短，沒(méi)有進(jìn)行骨密度相關(guān)檢測(cè)等方面，還存在不足，有待今后進(jìn)一步研究。