萬雷 黃宏興 張志海 王吉利 柴爽 劉少津 黃佳純

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬骨傷科醫(yī)院，廣東 廣州 510240 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種隨年齡增長，骨量逐漸丟失，骨微結(jié)構(gòu)破壞，因骨質(zhì)脆弱而易發(fā)生骨折的全身性骨代謝疾病，其發(fā)病與多種因素有關(guān)，且發(fā)病率逐年升高。據(jù)統(tǒng)計(jì)[1]現(xiàn)在全世界約有2億骨質(zhì)疏松患者，其發(fā)病率已躍居世界各種常見病的第七位，我國40歲以上人群骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率24.62%，約1.4億人罹患該病，男性與女性每10年骨質(zhì)疏松癥的增長率分別約為15%和20%。骨質(zhì)疏松癥及其伴隨骨折所造成的醫(yī)療費(fèi)用與癌癥相似甚或過之[2-3]。增齡所導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松等慢性退行性骨病是目前危害骨骼健康的重要問題，也是國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)[4]Wnt信號通路是與骨代謝關(guān)系密切的一條重要細(xì)胞信號通路，已發(fā)現(xiàn)眾多的胞內(nèi)蛋白質(zhì)分子參與Wnt信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)與調(diào)節(jié)。而Dickkopf (DKK)1和骨硬化蛋白Sclerostin(Sost)是Wnt信號通路的抑制因子，在Wnt信號通路介導(dǎo)的骨形成和骨代謝過程中發(fā)揮重要作用，被視為骨相關(guān)疾病如骨質(zhì)疏松、骨修復(fù)的治療靶點(diǎn)[5]。補(bǔ)腎健脾活血方是我院骨質(zhì)疏松課題組多年來臨床防治骨質(zhì)疏松癥的經(jīng)驗(yàn)方，前期研究證實(shí)其臨床療效顯著，且具有促進(jìn)骨形成和抑制骨吸收的雙向調(diào)節(jié)作用。為了研究補(bǔ)腎健脾活血方是否通過調(diào)控DKK1、Sost進(jìn)而影響成骨細(xì)胞的代謝，故開展本實(shí)驗(yàn)研究。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：6月齡SPF級健康雌性未孕SD大鼠16只，體重約240～260 g [南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號：SCXK(粵)2011-0015]。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥物：補(bǔ)腎健脾活血方由補(bǔ)骨脂、制淫羊藿、黃芪、丹參等10味中藥組成。其提取物中含生藥量1.43 g/mL，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬骨傷科醫(yī)院制劑室提供。

1.1.3主要試劑和儀器(見表1)。

表1 主要試劑和儀器及生產(chǎn)廠家Table 1 Main reagents, equipment and manufacturers

1.2 含藥血清制備

實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為空白血清組和含藥血清組(補(bǔ)腎健脾活血方，4.8 g/kg)，每組8只。每天灌胃兩次，連續(xù)灌胃3 d，最后一次灌胃后2 h 進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血，在3 000 r/min條件下離心取血清，放置-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

MG63細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至80%～95%融合時(shí)，棄舊液，加入0.25%胰酶消化液2 mL，再加入4 mL培養(yǎng)液終止消化，然后移至無菌離心管中，在1 000 r/min條件下離心4 min，棄上清，以1∶4～1∶6比例移至新培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

細(xì)胞培養(yǎng)24 h后分為空白對照組(NC組)、沉默DKK1(Ad-shDKK1)組、沉默Sost (Ad-shSost)組，用包裝好的空載腺病毒和沉默DKK1、Sost重組腺病毒分別轉(zhuǎn)染三組細(xì)胞，感染復(fù)數(shù)(MOI)為50。

1.5 細(xì)胞增殖檢測

用空載腺病毒和沉默DKK1、Sost重組腺病毒分別轉(zhuǎn)染培養(yǎng)好的NC組、Ad-shDKK1組和Ad-shSost組細(xì)胞，再分別用空白血清和含藥血清干預(yù)。轉(zhuǎn)染24、48、72 h 后，加入100 μL含10% CCK-8的培養(yǎng)基、在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1.5～2.5 h，于酶標(biāo)儀450 nm處檢測各孔的吸光度(A)值。

1.6 ALP活性檢測

空白血清和含藥血清分別干預(yù)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞72 h，裂解、提取、檢測細(xì)胞總蛋白，加入雙蒸水、酚標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液、緩沖液、基質(zhì)液，37 ℃孵育15 min，再加入顯色劑，于酶標(biāo)儀處檢測各孔的吸光度(A)值，并計(jì)算ALP活性。

1.7 骨相關(guān)蛋白檢測

上述三組細(xì)胞轉(zhuǎn)染72～96 h后，棄舊培養(yǎng)基，消化收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，并測定蛋白濃度，上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫反應(yīng)，化學(xué)發(fā)光顯色后，掃描存檔膠片，用Image J軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 血清干預(yù)后各組細(xì)胞活性變化(見表2)

表2顯示血清干預(yù)重組腺病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞后，細(xì)胞活性在培養(yǎng)24、48、72 h均有增強(qiáng)；三組含藥血清干預(yù)后的細(xì)胞活性均強(qiáng)于同時(shí)間點(diǎn)的空白血清干預(yù)后的細(xì)胞活性。NC組在24、48和72 h含藥血清干預(yù)比空白血清干預(yù)的細(xì)胞活性分別提高了1.07、1.216、1.187倍。Ad-shDKK1組在24、48、72 h含藥血清干預(yù)比空白血清干預(yù)的細(xì)胞活性分別提高了1.076、1.166、1.192倍。Ad-shSost組在24、48、72 h含藥血清干預(yù)比空白血清干預(yù)的細(xì)胞活性分別提高了1.115、1.189、1.183倍。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，含藥血清在24、48、72 h對Ad-shDKK1組、Ad-shSost組的細(xì)胞活性作用稍強(qiáng)于NC組，在72 h時(shí)含藥血清對Ad-shDKK1組的細(xì)胞活性作用更強(qiáng)，與同組空白血清比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 血清干預(yù)后的各組細(xì)胞活性變化Table 2 The changes of cell activity of in each group after serum

注：同組含藥血清與空白血清比較，*P<0.05。

2.2 血清干預(yù)后各組細(xì)胞ALP活性變化(見表3)

表3顯示三組含藥血清干預(yù)與空白血清干預(yù)比較ALP活性均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；空白血清干預(yù)后，與NC組比較，其余兩組ALP活性均顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與Ad-shDKK1組比較，Ad-shSost組ALP活性升高不明顯。含藥血清干預(yù)后，與NC組比較，其余兩組ALP活性均顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，Ad-shDKK1組和Ad-shSost組比較ALP活性升高不明顯。說明兩種血清均能升高沉默重組腺病毒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞ALP活性，其中補(bǔ)腎健脾活血方含藥血清升高細(xì)胞ALP活性明顯，可顯著促進(jìn)沉默DKK1、Sost重組腺病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞ALP活性的升高。

表3 各組ALP活性變化 Table 3 ALP activity changes in each

注：同組含藥血清與空白血清比較，**P<0.01；空白血清：與NC組比較，▲▲P<0.01；含藥血清：與NC組比較，△△P<0.01。

2.3 血清干預(yù)后各組骨細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)變化(見表4，圖1)

表4，圖1顯示與空白血清干預(yù)比較，含藥血清干預(yù)后NC組、Ad-shDKK1組和Ad-shSost組的CTGF、OPG、OPN均升高，Ad-shDKK1組低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5(low density lipoprotein receptor related protein,Lrp5)表達(dá)稍降低，其余兩組Lrp5表達(dá)升高。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)NC組和Ad-shDKK1組CTGF、OPG比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05和P<0.01)，Ad-shSost組CTGF比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。空白血清干預(yù)后，與NC組比較，Ad-shDKK1組和Ad-shSost組的Lrp5、OPG、OPN差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05和P<0.01)。含藥血清干預(yù)后，與NC組比較，Ad-shDKK1組OPG、OPN差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05和P<0.01)，Ad-shSost組CTGF、OPG、OPN差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說明含藥血清能進(jìn)一步上調(diào)沉默DKK1、Sost腺病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞CTGF、OPG、OPN的表達(dá)。

表4 各組骨細(xì)胞相關(guān)蛋白變化Table 4 The changes of bone cell related proteins in each

注：同組含藥血清與空白血清比較，*P<0.05，**P<0.01；空白血清：與NC組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；含藥血清：與NC組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

圖1 各組骨相關(guān)蛋白檢測結(jié)果Fig.1 Protein test results of bone related proteins in each group

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是一種退行性全身骨代謝疾病，其發(fā)病機(jī)制迄今仍未完全闡明，而且目前該病的治療方法不盡理想，臨床抗骨質(zhì)疏松藥物主要靶向破骨細(xì)胞，抑制骨吸收，但這并不能有效降低骨折發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)和增加骨密度，靶向成骨細(xì)胞和促進(jìn)骨形成的藥物較少，尋找調(diào)控成骨細(xì)胞促進(jìn)骨形成的藥物就顯得非常重要?，F(xiàn)代臨床統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，中醫(yī)藥在治療骨質(zhì)疏松中具有療效顯著，副作用小，安全性好的優(yōu)點(diǎn)。然而中醫(yī)用藥講究配伍和“君、臣、佐、使”，用現(xiàn)代醫(yī)藥的觀點(diǎn)來看是多種藥物聯(lián)合作用，具有多靶點(diǎn)協(xié)同作用的功效。補(bǔ)腎健脾活血方是我院骨質(zhì)疏松課題組根據(jù)骨質(zhì)疏松的腎虛、脾虛和血瘀中醫(yī)病機(jī)在補(bǔ)腎、健脾、活血治則基礎(chǔ)上選藥組方而成。筆者前期的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)[6-7]已經(jīng)證明補(bǔ)腎健脾活血方對去勢大鼠骨質(zhì)疏松病理狀態(tài)有明顯的改善作用，促使更進(jìn)一步研究補(bǔ)腎健脾活血方防治骨質(zhì)疏松的作用機(jī)理。

DKK1是Dickkopfs基因家族中的一員，1998年在兩棲動(dòng)物非洲蟾蜍胚胎細(xì)胞中被首次發(fā)現(xiàn)，并被編碼命名為DKK1[8]。在成年個(gè)體，DKK1主要在成骨細(xì)胞和成熟骨細(xì)胞中表達(dá)。由Sost基因表達(dá)的硬骨素(sclerostin,Sost)屬于胱氨酸結(jié)構(gòu)超家族的一員[9]，也能夠特異性地在成熟骨骼的骨細(xì)胞中表達(dá)[10]。DKK1和Sost都是骨形成的負(fù)調(diào)控因子，它們在許多骨骼疾病和某些腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著非常重要作用，對Wnt/?-catenin信號通路也有抑制作用，其作用途徑大都通過Wnt/?-catenin信號通路來實(shí)現(xiàn)。兩者作用機(jī)理相同，都可以競爭性結(jié)合受體LRP5/6或與Kremen1/2、LRP5/6共同結(jié)合形成三聚體，通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)吞作用移除細(xì)胞膜上的LRP5/6，阻止Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。Korvala等[11]研究認(rèn)為DKK1基因的變異在原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥發(fā)病中起著重要作用。也有研究證實(shí)拮抗Sost蛋白可以緩解骨質(zhì)疏松的癥狀。筆者前期研究[12]發(fā)現(xiàn)沉默DKK1、Sost重組腺病毒轉(zhuǎn)染具有人成骨細(xì)胞表型特征的MG63細(xì)胞后可促進(jìn)細(xì)胞增殖、提高ALP活性，降低鈣離子濃度，尤以二者同時(shí)沉默時(shí)的作用最強(qiáng)。還發(fā)現(xiàn)[13]補(bǔ)腎健脾活血方可提高過表達(dá)DKK1轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞活性，提高骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein,BMP2)相對表達(dá)量，有利于成骨細(xì)胞的礦化。為了進(jìn)一步研究補(bǔ)腎健脾活血方是否通過調(diào)控DKK1、Sost進(jìn)而影響成骨細(xì)胞的代謝，筆者在前期沉默DKK1、Sost重組腺病毒轉(zhuǎn)染的成骨細(xì)胞模型上進(jìn)行干預(yù)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含藥血清干預(yù)沉默DKK1、Sost重組腺病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞后，細(xì)胞活性在培養(yǎng)24、48、72 h均進(jìn)一步增強(qiáng)，高于同時(shí)間點(diǎn)空白血清干預(yù)后的細(xì)胞活性，尤其在72 h時(shí)含藥血清對Ad-shDKK1組的細(xì)胞活性促進(jìn)作用更強(qiáng)。ALP是成骨細(xì)胞分化的早期特異性指標(biāo)，也是礦化的先決條件，其含量的變化可預(yù)示骨細(xì)胞增殖程度。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)含藥血清可升高細(xì)胞ALP活性，也能顯著促進(jìn)沉默DKK1、Sost重組腺病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后ALP活性的升高。這說明補(bǔ)腎健脾活血方對沉默DKK1、Sost重組腺病毒轉(zhuǎn)染所引起的細(xì)胞增殖和ALP活性升高均有明顯促進(jìn)作用。

成骨細(xì)胞一方面合成骨基質(zhì)，增加骨量，另一方面分泌OPG、OPN等調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞形成、活化，影響骨吸收。OPG是腫瘤壞死因子受體家族成員，可通過與核因子κB受體活化因子配體結(jié)合，競爭性阻止核因子κB受體活化因子配體與破骨細(xì)胞中的核因子κB受體活化因子結(jié)合，抑制破骨細(xì)胞形成和活化[14]。OPN在骨基質(zhì)礦化、吸收和骨重塑等過程中均發(fā)揮重要作用，介導(dǎo)骨組織細(xì)胞與骨基質(zhì)間的橋接，廣泛參與了骨相關(guān)疾病的病程進(jìn)展，顯示出多效的生物學(xué)活性[15]。Lrp5存在于成骨細(xì)胞表面,它的表達(dá)改變和功能丟失,可導(dǎo)致體外培養(yǎng)鼠頭蓋骨質(zhì)密度減低,骨質(zhì)厚度變薄，并在人的成長過程中影響骨質(zhì)獲得[16]。CTGF是一種可刺激成纖維細(xì)胞增殖和分泌膠原的生長因子，還具有促細(xì)胞增殖、遷移及分化等作用[17]。本實(shí)驗(yàn)對沉默DKK1、Sost重組腺病毒轉(zhuǎn)染的具有人成骨細(xì)胞表型特征的MG63細(xì)胞進(jìn)行蛋白檢測，發(fā)現(xiàn)與空白血清干預(yù)比較，含藥血清干預(yù)后NC組、Ad-shDKK1組和Ad-shSost組的CTGF、OPG、OPN表達(dá)均升高，Ad-shDKK1組Lrp5表達(dá)稍降低，其余兩組Lrp5表達(dá)則有升高。結(jié)合DKK1和Sost是Wnt信號通路的抑制因子，可以競爭性結(jié)合Wnt信號通路中的共受體Lrp5/6來抑制該信號通路的正常信號傳導(dǎo)，二者沉默后可促進(jìn)Wnt信號傳導(dǎo)，成骨細(xì)胞增殖分化能力相對增強(qiáng)，導(dǎo)致成骨細(xì)胞分泌的促骨形成蛋白表達(dá)升高。這說明補(bǔ)腎健脾活血方能進(jìn)一步上調(diào)沉默DKK1、Sost腺病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞CTGF、OPG、OPN的表達(dá)，而對Lrp5的影響作用有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

Wnt信號通路是調(diào)控成骨細(xì)胞分化和骨基質(zhì)形成的關(guān)鍵途徑，DKKl和Sost僅在成骨細(xì)胞或骨細(xì)胞中表達(dá)，因此，系統(tǒng)處理DKKl和Sost將可能只影響骨組織Wnt信號通路，增強(qiáng)骨形成，而不影響其他器官。補(bǔ)腎健脾活血方含藥血清可提高細(xì)胞增殖和ALP活性，升高CTGF、OPG和OPN的表達(dá)，尤其在沉默DKK1和Sost重組腺病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，仍可促進(jìn)細(xì)胞增殖、成熟和礦化，并上調(diào)上述蛋白的表達(dá)，這提示補(bǔ)腎健脾活血方可能具有調(diào)控DKK1和Sost的作用，為補(bǔ)腎健脾活血方治療骨質(zhì)疏松癥提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。然而，本研究中含藥血清和空白血清都提高了細(xì)胞增殖和ALP活性，影響CTGF、Lrp5、OPG和OPN的表達(dá)，不能完全說明補(bǔ)腎健脾活血方是通過Wnt信號通路來影響成骨細(xì)胞的增殖，可能還存在其他未知的作用機(jī)制，有待進(jìn)一步的研究證實(shí)。