宋東強(qiáng)，史冬敏，張順財(cái)

1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝癌研究所，上海 200032 2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院消化科，上海 200032

近期，Science、MolecularCell雜志分別報(bào)道了環(huán)狀RNA(circular RNA, circRNA)的最新研究成果[1-2]，使circRNA重新受到廣泛關(guān)注。circRNA是一類普遍存在于真核細(xì)胞基因組中，具有基因調(diào)控作用的內(nèi)源性RNA。20世紀(jì)70年代，circRNA首次在病毒中被發(fā)現(xiàn)[3]，隨后在酵母線粒體中被找到[4]。在過去近30年內(nèi)，circRNA被證實(shí)存在于病毒、古生菌、植物和人體細(xì)胞等多種生物體內(nèi)[5-9]。但其一直被認(rèn)為是在轉(zhuǎn)錄過程中錯(cuò)誤剪接而形成的副產(chǎn)物，無重要生物學(xué)功能。

近年來，隨著生物物理學(xué)、RNA測序技術(shù)和生物信息學(xué)等技術(shù)的快速發(fā)展，高通量、長讀段為特征的大量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)被發(fā)現(xiàn)，生物體中越來越多的 circRNA隨之被發(fā)現(xiàn)。Memczak等[10]通過RNA-seq數(shù)據(jù)結(jié)合人白細(xì)胞數(shù)據(jù)庫，在人類、小鼠及線蟲中分別鑒定出1 950種、1 903種和724種circRNA(其中小鼠與人類有81種circRNA相同)，并成立了1個(gè)circRNA數(shù)據(jù)庫(http://www.circbase.org/)，可在線查詢。Liu等[11]通過檢測464例人RNA-seq樣本的全轉(zhuǎn)錄組，鑒定了circRNA的表達(dá)譜(包含已知和新發(fā)現(xiàn)的circRNA)，并在此基礎(chǔ)上建立了目前第1個(gè)提供組織特異性的circRNA表達(dá)譜以及circRNA-miRNA基因調(diào)節(jié)通路的公共數(shù)據(jù)庫，即CircNet Database (http://circnet.mbc.nctu.edu.tw/)。上述研究使人們認(rèn)識(shí)到基因外顯子可3′端和5′端共價(jià)連接形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的circRNA在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)豐富且穩(wěn)定，這種結(jié)構(gòu)能抗RNA外切酶降解。

1 circRNA的形成

關(guān)于circRNA的形成機(jī)制尚無定論，目前主要有2種機(jī)制。(1)在轉(zhuǎn)錄過程中，前體mRNA(pre-mRNA)中的外顯子轉(zhuǎn)錄本被非線性地反向剪接形成circRNA，分為套索驅(qū)動(dòng)的環(huán)化和內(nèi)含子配對驅(qū)動(dòng)的環(huán)化(圖1A,1B)。這種circRNA被稱為外顯子來源的circRNA[12-13]。(2)另外一種理論認(rèn)為內(nèi)含子也可以形成circRNA。Zhang等[14]提出了內(nèi)含子自身環(huán)化(圖1C)，這類由內(nèi)含子自身環(huán)化形成的circRNA被稱為內(nèi)含子circRNA。

圖1 環(huán)狀RNA形成示意圖

A：內(nèi)含子配對驅(qū)動(dòng)的環(huán)化[15]；B：套索驅(qū)動(dòng)的環(huán)化[15]；C：內(nèi)含子自身環(huán)化[14]

2 circRNA的特征

circRNA的主要特征包括：(1)circRNA廣泛存在于多種真核生物中，包括人類[16-18]；(2)主要位于細(xì)胞質(zhì)，少數(shù)位于細(xì)胞核[14]，非常穩(wěn)定，不易被核酸外切酶RNaseR降解[10,16,19]；(3)大部分circRNA具有高度保守序列[16,18]；(4)circRNA主要來源于外顯子，內(nèi)含子來源circRNA及由外顯子和內(nèi)含子共同組成的 circRNA則較少[10,16,19-20]；(5)有些circRNA具有微小RNA(microRNA，miRNA)結(jié)合位點(diǎn)，能與miRNA相互結(jié)合，從而調(diào)控靶基因的表達(dá)[6,16]；(6)大部分通常不編碼蛋白，屬于非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)[16]；(7)主要在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)控作用[14,19]；(8)少量circRNA可以翻譯成蛋白質(zhì)[21]。

3 circRNA與腫瘤的相關(guān)性

circRNA的miRNA海綿作用使其能通過競爭性吸附內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)調(diào)控基因表達(dá)[10, 22]，具體表現(xiàn)為circRNA通過結(jié)合miRNA來阻斷其對特異靶mRNA的抑制作用，從而調(diào)控miRNA靶基因的表達(dá)水平[23]。此外，circRNA還能夠作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，調(diào)控RNA表達(dá)[23]、蛋白質(zhì)活性[10, 22]等功能。

3.1 ciRS-7/CDRlas作用機(jī)制 circRNA可以通過多個(gè)途徑影響腫瘤的進(jìn)程。ciRS-7/CDRlas是目前研究較多的一種circRNA，其miR-7結(jié)合位點(diǎn)超過70個(gè)；ciRS-7/CDRlas通過結(jié)合miR-7抑制miR-7的活性[10]，進(jìn)而調(diào)控miR-7靶基因的表達(dá)[22]。而miR-7涉及多種生物學(xué)通路，可直接作用于腫瘤發(fā)生的相關(guān)靶基因，調(diào)控腫瘤因子的表達(dá)。

大量研究[24]表明，miR-7對腫瘤具有明顯的抑制作用。在腫瘤增殖及轉(zhuǎn)移研究中，miR-7通過靶向作用于黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)的3′非編碼區(qū)，負(fù)向調(diào)節(jié)其表達(dá)水平，阻斷乳腺癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)過程，進(jìn)而抑制了癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力[24]。PAX6是表達(dá)于結(jié)直腸癌細(xì)胞的高度保守的轉(zhuǎn)錄因子，其通過激活ERK/PI3K信號(hào)通路，上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)的表達(dá)水平，促進(jìn)結(jié)直腸癌的進(jìn)展；PAX6也是miR-7的直接靶標(biāo)，兩者表達(dá)負(fù)相關(guān)，miR-7能下調(diào)PAX6的表達(dá)，抑制結(jié)直腸癌的生長、增殖、轉(zhuǎn)移[25]。Fang等[26]發(fā)現(xiàn)，miR-7可以靶向作用于蘇氨酸激酶(Akt)，負(fù)性調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)通路，從而將肝癌細(xì)胞周期阻斷在G0/G1期。在舌鱗癌中，miR-7促使胰島素生長因子1受體(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R) 下調(diào)，從而削弱IGF1誘導(dǎo)Akt活化的能力，進(jìn)而阻斷細(xì)胞周期，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[27]。在乳腺癌MDA-MB-468、肺癌A549細(xì)胞及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤DU145中，miR-7能顯著降低表皮生長因子受體( epidermal growth factor receptor protein，EGFR)的表達(dá)水平，從而抑制腫瘤細(xì)胞周期,基因芯片進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，癌基因Raf1、蛋白激酶B(PKB)及細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶 1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)的下降[28]。但是，miR-7也有促癌作用。如病毒致癌基因E6/E7在HPV陽性的HeLa細(xì)胞系中的表達(dá)水平與miR-7正相關(guān)[29]。Nakagawa等[30]發(fā)現(xiàn)，miR-7在人結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平顯著高于正常黏膜。因此，ciRS-7/CDRlas通過調(diào)控miR-7水平而調(diào)節(jié)腫瘤增殖及轉(zhuǎn)移等。

3.2 消化道惡性腫瘤 Bachmayr-Heyda等[31]通過對31對人結(jié)腸癌組織和相應(yīng)的癌旁組織進(jìn)行RNA測序，發(fā)現(xiàn)circRNA的豐度顯著低于對應(yīng)的正常結(jié)腸組織。Li等[32]通過檢測101對胃癌及癌旁組織標(biāo)本中hsa_cir_002059的表達(dá)水平及其與臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)該circRNA在胃癌組織中表達(dá)下調(diào)，且與TNM分期以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示hsa_cir_002059可作為胃癌診斷的一個(gè)潛在分子標(biāo)志物。另外，Li等[33]分別對358、326對人食管癌和對應(yīng)的癌旁組織進(jìn)行qRT-PCR檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，cir-ITCH在食管癌的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。cir-ITCH通過海綿吸附miR-216b、miR-17、miR-214、miR-7和miR-128，間接提高miRNA靶基因ITCH的表達(dá)水平，而高表達(dá)的ITCH能夠促進(jìn)磷酸化Dvl2的泛素化和降解，通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[33]。

3.3 肝細(xì)胞肝癌 Qin等[34]發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0001649在肝癌細(xì)胞中明顯下調(diào)，其表達(dá)與腫瘤大小明顯負(fù)相關(guān)(P=0.045)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0001649的表達(dá)與癌栓形成相關(guān)。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，用siRNA下調(diào)肝癌細(xì)胞系HCC-LM3和MHCC-97L中的hsa_circ_0001649，MMP9、 MMP10和MMP13的mRNA表達(dá)水平顯著上升，表明hsa_circ_0001649可能與肝癌轉(zhuǎn)移密切有關(guān)。Huang等[35]應(yīng)用基因芯片技術(shù)分別檢測了肝癌及癌旁組織circRNA的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比，肝癌組織中有226個(gè)circRNA的表達(dá)有明顯差異，其中189個(gè)上調(diào)、37個(gè)下調(diào)；通過qRT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，hsa_circRNA_104075和 hsa_circRNA_100338明顯上調(diào)。Huang等[35]進(jìn)一步在臨床上選擇了80例乙肝相關(guān)的肝細(xì)胞肝癌患者的肝癌組織樣本，選擇表達(dá)明顯升高的hsa_circRNA_100338作為檢測目的基因，發(fā)現(xiàn)癌組織及癌旁組織均有circRNA_100338表達(dá)，且circRNA_100338低表達(dá)組的累計(jì)生存率(72%)明顯高于高表達(dá)組(42.9%)；circRNA_100338表達(dá)與TNM分期、血管侵襲和肺轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，circRNA_100338可以作為乙肝相關(guān)肝癌預(yù)后評(píng)價(jià)的生物標(biāo)志物。

circRNA還有可能通過調(diào)控肝癌細(xì)胞細(xì)胞周期促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。Ren等[36]應(yīng)用Arraystar Human circRNA Array 和Arraystar Human mRNA Array芯片分析肝癌組織的circRNA和mRNA，發(fā)現(xiàn)127個(gè)circRNA(113上調(diào)、14下調(diào))和3 235個(gè)mRNA(1 923個(gè)上調(diào)、1 312個(gè)下調(diào))的表達(dá)有顯著差異。通過KEGG Pathway分析和GO 分析3 235個(gè)mRNA發(fā)現(xiàn)，表達(dá)上調(diào)的mRNA主要參與細(xì)胞周期及細(xì)胞分裂，而下調(diào)基因與各種代謝過程有關(guān)。該研究選擇了5個(gè)上調(diào)最顯著的circRNA作為研究對象，通過miRNA數(shù)據(jù)庫預(yù)測circRNA與miRNA 的相互作用，構(gòu)建circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)。GO富集分析發(fā)現(xiàn)，這些mRNA參與腫瘤相關(guān)信號(hào)通路，如p53信號(hào)通路、血管生成和細(xì)胞周期信號(hào)通路。為了驗(yàn)證預(yù)測結(jié)果的準(zhǔn)確性，Ren等[36]進(jìn)一步在40例肝癌組織樣本中，應(yīng)用qRT-PCR分析這5 個(gè)circRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比，肝癌組織中circZFR、circFUT8和circPO11表達(dá)水平顯著升高，與芯片分析結(jié)果一致，說明circZFR、circFUT8和circPO11可作為腫瘤診斷及治療新的生物標(biāo)志物。

3.4 其他腫瘤 類似的生物信息學(xué)技術(shù)同樣在其他腫瘤[37-39]中得到廣泛應(yīng)用。越來越多的腫瘤，如肺癌[40]、口腔鱗癌[41]中發(fā)現(xiàn)了circRNA的表達(dá)，且參與多種信號(hào)通路的調(diào)控，為腫瘤的早期診斷及治療提供新的依據(jù)及治療靶點(diǎn)。

4 問題與展望

腫瘤是嚴(yán)重威脅人類生命健康的惡性疾病。由于癌癥的復(fù)雜性，人們對癌癥發(fā)生和發(fā)展機(jī)制的認(rèn)識(shí)還不能滿足對其防、診、治的需求。因此，深入解析癌癥發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制和調(diào)控規(guī)律，進(jìn)而研發(fā)癌癥的早期檢測、分子分型和預(yù)后預(yù)測方法及新型治療藥物等，是生物醫(yī)學(xué)研究的重要任務(wù)。隨著新一代RNA測序技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，circRNA在越來越多的腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，且對各種腫瘤中circRNA的結(jié)構(gòu)、功能有了更深入的理解。circRNA表達(dá)穩(wěn)定、半衰期長，同時(shí)在不同腫瘤中特異表達(dá)等特點(diǎn)，使其可能成為新的腫瘤標(biāo)志物應(yīng)用于腫瘤的早期診斷和篩查。同時(shí)，circRNA表達(dá)與腫瘤生物學(xué)特性密切相關(guān)，使其可能成為腫瘤個(gè)體化治療及靶向治療等新藥研發(fā)的新靶點(diǎn),將來可以通過人工合成circRNA的方式將其應(yīng)用于腫瘤的靶向治療。但circRNA仍有很多未知功能有待進(jìn)一步研究，其臨床適用性也需要進(jìn)一步探索。