肖志勇

福建拓天生物科技有限公司，福建 福州 350000

肝纖維化是多種原因引起的慢性肝病演化為肝硬化的中間必經(jīng)階段。肝硬化是不可治愈的，而肝纖維化是可治愈的。肝纖維化若及時(shí)在早期發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行有效的治療，可得到完全逆轉(zhuǎn)而治愈。四氯化碳（CCl4）是一種常用于誘導(dǎo)構(gòu)建肝纖維化模型的肝毒素，進(jìn)入體內(nèi)會(huì)導(dǎo)致血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）與谷丙轉(zhuǎn)氨酶（cereal third transaminase，ALT）的升高，引起肝損傷，長(zhǎng)時(shí)間給予CCl4將會(huì)導(dǎo)致肝損傷轉(zhuǎn)化為肝纖維化[1]。

姜黃（Curcuma longaL.）是姜科草本植物，是一種廣泛種植于亞洲的傳統(tǒng)藥草[2]。姜黃中含有包括多酚鐵結(jié)合姜黃素復(fù)合物和相關(guān)姜黃素的高含量的生物活性復(fù)合物[3-4]，具有很長(zhǎng)的藥用歷史，在中國(guó)已有數(shù)百年用于治療肝病的歷史[5]。

目前，采用超聲波提取法、研磨提取法及醇提取法等可獲得具有生物活性的姜黃提取物。2016年，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)多卡斯生物技術(shù)公司（DoCas Biotech）生產(chǎn)的姜黃提取物為食品中“安全使用物質(zhì)（GRAS）”[6]。姜黃提取物主要成分為姜黃素、脫甲氧基姜黃素，雙脫甲氧基姜黃素等。姜黃提取物有抗腫瘤、抗氧化、抗血脂、促纖溶作用、增強(qiáng)免疫力等功能[7-9]。

姜黃素是一種天然食用色素，亦是姜黃提取物中主要活性成分之一。姜黃素的藥理作用廣泛，包括抗腫瘤、抗炎、保肝等[1]。研究表明，姜黃素可抑制肝癌H22荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)，使CCl4所致肝損傷小鼠血清ALT的升高顯著降低[10]；姜黃素能夠通過(guò)顯著抑制CCl4誘導(dǎo)的血清中AST、ALT的升高，增強(qiáng)肝細(xì)胞抵抗磷脂氧化的作用，保護(hù)生物膜的完整性[11]；姜黃素能減輕CCl4誘導(dǎo)大鼠發(fā)生的肝損傷與肝纖維化[12]。這說(shuō)明姜黃素對(duì)肝臟有一定的保護(hù)作用。

我們通過(guò)建立CCl4誘導(dǎo)型肝纖維化小鼠模型，探究姜黃提取物對(duì)小鼠肝纖維化的影響，為開(kāi)發(fā)治療肝纖維化藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

C57BL/6小鼠，健康雄性，6周齡，體重18～22 g（南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院）。

α腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒、白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；總膽固醇（total cholesterol，TC）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒（南京建成生物科技有限公司）；Masson三色染色液（北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 姜黃提取物的制備

稱(chēng)取50 kg姜黃，重復(fù)榨汁2次，姜黃汁和姜黃渣待用；將姜黃汁于60～70℃濃縮至比重為1.1～1.4，獲得姜黃汁濃縮液，待用；姜黃渣置于其重量6倍的75%乙醇中浸泡2 h后，加熱至60～70℃回流提取2 h，獲得以姜黃素等為主要成分的醇提液；醇提后的姜黃渣置于其重量6倍的蒸餾水中，加熱至80℃提取2 h，獲得以多糖為主要成分的水提液；將醇提液和水提液合并，加熱至60～70℃，濃縮至比重為1.1～1.4，獲得提取濃縮液；將姜黃汁濃縮液和提取濃縮液合并，加入濃縮液重量2%的糊精并攪拌均勻，降低濃縮液黏稠度；濃縮液進(jìn)行噴霧干燥，即獲得姜黃提取物。

1.3 肝纖維化小鼠模型的建立

C57BL/6雄性小鼠12只，隨機(jī)分為正常組、模型組、姜黃素提取物給藥組、姜黃素給藥組，共4組，每組3只。除正常組外，其余各組腹腔注射20%CCl4-橄欖油溶液（5 mL/kg體重），1周注射2次，連續(xù)注射6周，建立小鼠肝纖維化模型。正常組予以相同劑量的橄欖油皮下注射，注射時(shí)間與其余組相同。

1.4 給藥處理

姜黃提取物給藥組和姜黃素給藥組分別用溶于0.1%DMSO的姜黃素提取物和姜黃素進(jìn)行灌胃（100 mg/kg體重），正常組和模型組小鼠用0.1%DMSO灌胃（100 mg/kg體重）。各組均每天灌胃1次 ，連續(xù)灌胃30 d。

1.5 血液采集及血清制備

給藥灌胃實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各個(gè)小鼠分別稱(chēng)重，摘除眼球采集血液，離心后獲得血清。

1.6 肝臟采集及處理

將小鼠脫頸，打開(kāi)腹腔采集肝臟組織，稱(chēng)取重量。將肝臟組織分為2部分，一部分迅速置液氮中冷凍，-80℃保存；另一部分用4%多聚甲醛固定，制作石蠟切片，用于HE及Masson染色分析。

1.7 小鼠血清生化指標(biāo)檢測(cè)

利用Ysmex-2100全自動(dòng)血液分析儀（希森美康生物科技有限公司）檢測(cè)小鼠血清中ALT、AST、TC、甘油三酯（triglyceride，TG）指標(biāo)；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法（ELISA）測(cè)定血清中TNF-α及IL-6的水平。具體檢測(cè)操作按相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.8 小鼠肝臟生化指標(biāo)檢測(cè)

小鼠肝臟中TC、TG、SOD、MDA、GSH-Px指標(biāo)的檢測(cè)按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.9 小鼠肝臟組織病理切片的HE染色和Masson染色

1.9.1 染色前處理 取小鼠肝臟組織塊放入10%福爾馬林中固定，放入一系列濃度梯度的酒精和二甲苯中分別進(jìn)行脫水和透明，在已溶解的石蠟中進(jìn)行包埋，切片貼片，放入一系列濃度梯度的二甲苯中脫蠟，再經(jīng)過(guò)一系列從高到低濃度梯度的酒精，最后放入蒸餾水中片刻，即可進(jìn)行染色。

1.9.2 HE染色 將已入蒸餾水后的切片放入蘇木精水溶液中染色5 min；酸水及氨水中分色，各10 s；流水沖洗1 h后入蒸餾水片刻；放入70%和90%酒精中各10 min脫水；放入酒精伊紅染色液中染色2 min；經(jīng)無(wú)水乙醇脫水和二甲苯透明，滴上加拿大樹(shù)膠，蓋上蓋玻片封固，即可用顯微鏡觀察。

1.9.3 Masson染色 根據(jù)Masson三色染色液的說(shuō)明書(shū)對(duì)脫蠟至入水的切片進(jìn)行Masson染色，染色封固后用顯微鏡觀察。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS19.0分析單因素方差，數(shù)據(jù)均以x±SD表示，認(rèn)為P＜0.05時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 姜黃提取物對(duì)肝纖維化小鼠血清生化指標(biāo)的影響

姜黃提取物對(duì)肝纖維化小鼠血清生化指標(biāo)的影響如表1所示。與正常組相比較，模型組小鼠血清中的ALT、AST、TG、TNF-α和IL-6水平顯著升高，而TC則顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組相比較，姜黃提取物及姜黃素給藥組小鼠血清中的 ALT（P＜0.01）、AST（P＜0.01）、TNF-α（P＜0.05）、IL-6（P＜0.05）均顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；姜黃素給藥組的TG也顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而姜黃提取物給藥組的TG無(wú)顯著變化，但2組小鼠血清中的TC無(wú)顯著變化；與姜黃素給藥組相比，姜黃提取物給藥組血清的各個(gè)指標(biāo)均無(wú)顯著變化。

2.2 姜黃提取物及姜黃素對(duì)肝纖維化小鼠肝臟生化指標(biāo)的影響

結(jié)果見(jiàn)表2。與正常組相比較，模型組小鼠肝臟中的TC和SOD均顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；TG、MDA和GSH-Px均無(wú)顯著變化。與模型組相比，經(jīng)姜黃素提取物及姜黃素給藥組的小鼠肝臟中TG、TC、SOD、MDA和GSH-Px均無(wú)顯著變化。

表1 姜黃提取物對(duì)小鼠血清生化指標(biāo)的影響（x±SD）

2.3 姜黃提取物對(duì)小鼠肝臟組織病理的影響

用光學(xué)顯微鏡觀察各組小鼠肝臟組織的病理形態(tài)，以確定姜黃提取物對(duì)小鼠肝臟組織病理的影響，結(jié)果如圖1、2。正常組小鼠肝臟組織的匯管區(qū)、小葉、肝細(xì)胞的膽管未見(jiàn)異常，細(xì)胞排列界限清晰，無(wú)明顯的膠原纖維沉積，未見(jiàn)纖維增生的現(xiàn)象發(fā)生。模型組小鼠肝臟組織的匯管區(qū)出現(xiàn)部分炎細(xì)胞浸潤(rùn)；小葉結(jié)構(gòu)異常紊亂，不能分辨；肝臟組織有明顯的膠原纖維沉積，肝細(xì)胞的膽管增生明顯，細(xì)胞發(fā)生明顯壞死。與模型組相比，姜黃提取物給藥組小鼠肝臟匯管區(qū)的炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，肝細(xì)胞的膽管增生和肝組織膠原纖維含量明顯減少。與姜黃素給藥組相比，姜黃提取物給藥組無(wú)顯著差異。

3 討論

纖維化在多種器官（大腦、肺臟、心血管系統(tǒng)、腎臟、胰腺等）中均可發(fā)生，持續(xù)發(fā)展將嚴(yán)重致死。肝臟具有生物轉(zhuǎn)化作用，是機(jī)體內(nèi)代謝及排毒的重要器官，因而也是用于研究纖維化的理想器官。迄今，大多關(guān)于纖維化的研究都是在動(dòng)物肝臟中進(jìn)行的。相較于檢測(cè)肝纖維化的一般血清標(biāo)志物［如層粘連蛋白（LN）、Ⅲ型前膠原（PCⅢ）、Ⅳ型膠原（Ⅳ-C）、ALT及AST等］，新型血清分子標(biāo)志物（如非編碼RNA、成纖維細(xì)胞因子、ECM相關(guān)標(biāo)志物及分子組學(xué)等）能準(zhǔn)確鑒別肝纖維化的程度，有助于更全面地分析肝纖維化病因[13]。

目前，治療肝纖維化的藥物療效并不理想，安全有效的藥物有待開(kāi)發(fā)，此研究方向已受到國(guó)內(nèi)外重視[14]。研究表明，中草藥植物及從中提取的有效成分對(duì)肝纖維化具有治療作用[15-16]。已有研究表明，采用灌胃方法進(jìn)行姜黃提取物給藥，對(duì)小鼠的精神神經(jīng)系統(tǒng)、血壓、呼吸及心電圖的影響不明顯[17]。2016年美國(guó)FDA已批準(zhǔn)姜黃提取物為食品“安全使用物質(zhì)”[6]，而姜黃素是姜黃提取物中的主要生物活性成分，說(shuō)明姜黃提取物及姜黃素均是相對(duì)安全的藥物。本實(shí)驗(yàn)研究了姜黃提取物對(duì)CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化的影響，結(jié)果證明姜黃提取物有改善肝纖維化的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，姜黃提取物及姜黃素給藥的2組小鼠之間的指標(biāo)及病理學(xué)形態(tài)無(wú)顯著差異，即姜黃提取物與姜黃素兩者的效果相當(dāng)，說(shuō)明在小鼠肝纖維化治療恢復(fù)中，姜黃提取物的有效成分姜黃素起主要作用。相比于姜黃素的提取純化操作復(fù)雜及高成本，姜黃提取物的制備操作簡(jiǎn)單，成本低，作為治療肝纖維化的藥物具有一定的優(yōu)勢(shì)。因此，本實(shí)驗(yàn)為開(kāi)發(fā)新型低成本的安全、有效、理想的治療肝纖維化藥物奠定了基礎(chǔ)。

表2 姜黃提取物對(duì)小鼠肝臟生化指標(biāo)的影響（x±SD）

圖1 各組小鼠肝臟組織病理學(xué)形態(tài)（HE，×100）

圖2 各組小鼠肝臟組織病理學(xué)形態(tài)（Masson，×400）