劉潔，李備，劉春，陳露，梁揚，周玦飛，陳贊民

1.海南省藥品檢驗所，海南 ?？?570216；2.海南省食品檢驗檢測中心，海南 ?？?570311

腫瘤是指機體在各種致瘤因子作用下，局部組織細胞增生所形成的新生物，因為這種新生物多呈占位性塊狀突起，也稱贅生物。腫瘤的治療一直是世界難題，盡管市場上有多種藥物，但由于其不良反應(yīng)，導(dǎo)致對新藥的需求一直處于饑渴狀態(tài)。

唇形科（Labiatae）黃芩屬（Scutellaria）植物資源十分豐富，全世界共有300余種。該屬物種多具有清熱燥濕、瀉火解毒之功效[1-2]。黃芩屬植物具有廣泛的藥理作用，如抗腫瘤、保肝、抗氧化等活性?，F(xiàn)代化學(xué)成分研究表明，黃酮和二萜為其主要活性成分[3]。海南黃芩（S.hainanensis）分布于海南地區(qū)，長于石山上，是海南特有植物，具有清熱解毒的功效[4]。我們用多種提取分離技術(shù)獲得黃芩中的漢黃芩素，并利用核磁共振（NMR）等技術(shù)對其結(jié)構(gòu)進行鑒定；采用肺癌、肝癌、胃癌、宮頸癌等常見腫瘤細胞，利用MTT法測定漢黃芩素的細胞毒活性；采用S180移植的荷瘤小鼠，對漢黃芩素進行體內(nèi)腫瘤實驗。結(jié)果表明漢黃芩素有很強的抗腫瘤活性，這為深入研究與開發(fā)海南黃芩提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

海南黃芩于2014年8月采自海南省霸王嶺；BLAB/c小鼠（北京維通利華動物有限公司）；宮頸癌HeLa細胞、肝腫瘤HepG2細胞、肺癌A549細胞（ATTC）；乳腺癌4T1細胞（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)所細胞中心）；紫杉醇（PTX）注射液（?？谑兄扑帍S有限公司）。

Bruker AVⅢ600型核磁共振儀；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；島津LC-10AD二元低壓半制備液相色譜儀；HiChrom Apollo C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；Agilent半制備色譜柱（Phenyl，2.5 mm×25.0 cm，5 μm）；智能生化培養(yǎng)箱（丙林，SPX系列）；島津20A高效液相色譜儀；薄層色譜預(yù)制板（青島海洋化工廠）；柱色譜硅膠（100～200目，200～300目，青島海洋化工廠）；Sephadex LH-20（Healthcare公司）；RPMI 1640完全培養(yǎng)基（Sigma公司）。

1.2 提取黃酮類化合物

干燥粉碎后的海南黃芩（5 kg）用95%乙醇（20 L）冷浸24 h，然后采用加熱回流方式提取，共提取3次，每次2 h。減壓回收溶劑，直至乙醇味消失。母液加水后用石油醚萃取，繼而采用氯仿萃取，濃縮后得到50 g浸膏。

1.3 分離純化黃酮類化合物

將氯仿萃取物進行硅膠柱色譜分析，采用氯仿-丙酮梯度洗脫，經(jīng)合并后得到洗脫物Fr.A～Fr.C。Fr.C通過硅膠柱色譜、凝膠柱色譜、反相高效液相制備色譜得漢黃芩素（9.0 mg）。

1.4 測定黃酮類化合物純度

稱取5個化合物各約2 mg，精密稱定，分別至100 mL量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，即得供試品。

采用HiChrom Apollo C18色譜柱，流動相A為0.3%磷酸，流動相B為甲醇∶乙腈=2∶3，流動相A∶流動相B=40∶60，流速1.0 mL/min，柱溫35℃，進樣量20 μL，檢測波長280 nm。

1.5 核磁測定方法

采用Bruker AVⅢ600型核磁共振儀，溶劑為DMSO-d6，1H-NMR 為 600 MHz，13C-NMR 為 150 MHz。

1.6 活性成分足量制備

應(yīng)用制備型高效液相色譜、高速逆流色譜或超臨界流體色譜對活性顯著的化合物漢黃芩素進行足量制備，儲備用于動物實驗的樣品。

1.7 海南黃芩化學(xué)成分的細胞毒活性評價方法

漢黃芩素分別用溶劑DMSO溶解，體外抗腫瘤活性測定采用MTT法篩選體系，所有樣品的抗腫瘤活性均使用宮頸癌HeLa細胞、肝腫瘤HepG2細胞、肺癌A549細胞進行實驗。

1.7.1 細胞培養(yǎng) 常規(guī)方法培養(yǎng)，在底面積為25 cm2的培養(yǎng)瓶中加入RPMI1640完全培養(yǎng)基，含10%體積的新生牛血清、100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素。細胞于37℃、5%CO2，相對濕度100%的恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。每日觀察細胞生長狀態(tài)，對生長密度超過80%瓶底面積的細胞進行消化傳代。消化液用0.25%胰酶-0.02%EDAT，每次傳代比例1∶3，以保證細胞一直處于對數(shù)生長期。

1.7.2 細胞接板 取對數(shù)生長期細胞，按5000～8000/孔接入96孔板，培養(yǎng)24 h后加藥。

1.7.3 藥物處理 用完全培養(yǎng)基梯度稀釋藥液，過濾除菌，加入96孔板中，200 μL/孔。每次實驗設(shè)置6個空白對照孔（僅含完全培養(yǎng)基），藥物濃度組設(shè)置1∶100、1∶500、1∶1000共3個梯度，每個梯度3個復(fù)孔。

1.7.4 MTT處理 將MTT溶于0.01 mol/L（pH7.4）的PBS緩沖液中，配成終濃度為5 mg/mL的溶液，0.22 μm濾膜過濾除菌。藥物作用48 h后棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，加MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去MTT溶液，PBS洗滌2次，用20 μL DMSO裂解細胞，溶解甲攢化合物。

1.7.5 測定及計算 用IC50計算軟件計算半數(shù)抑制濃度。

1.8 海南黃芩中漢黃芩素體內(nèi)抗腫瘤試驗

1.8.1 腫瘤動物模型的建立 BALB/c小鼠，雌性，體重20±1 g，實驗前飼養(yǎng)觀察1周。培養(yǎng)4T1細胞至對數(shù)期，胰酶消化，用無菌生理鹽水調(diào)整瘤細胞懸液濃度為1×106/mL，備用。BALB/c小鼠右腋下注射0.2 mL 4T1細胞懸液，腫瘤生長至第7 d，體積達到約100 mm3，篩選腫瘤大小相對一致的小鼠進行實驗。

1.8.2 動物模型分組及給藥 選擇上述腫瘤模型動物32只，隨機分成4組，陰性與陽性對照組每組10只，藥物組每組6只。陰性對照組給予生理鹽水，陽性對照組尾靜脈注射10 mg/kg[5]市售紫杉醇（PTX）注射液；通過查閱文獻[6]及預(yù)實驗，藥物低劑量組、藥物高劑量組分別灌胃給予10、40 mg/kg海南漢黃芩素，連續(xù)7 d。

1.8.3 藥效學(xué)指標考察 每次給藥時稱量小鼠體重，用游標卡尺測量小鼠腫瘤體積，每日觀察小鼠毛發(fā)、活動、睡眠及死亡等一般狀況。實驗結(jié)束后，脫臼處死小鼠，完整剝離腋下腫瘤組織，稱瘤重，計算抑瘤率（%）=（1-治療組平均瘤重/陰性對照組平均瘤重）×100%。

2 結(jié)果

2.1 漢黃芩素結(jié)構(gòu)鑒定

化合物為無色油狀物，HPLC歸一化法測得純度為97.1%（圖1）。根據(jù)化合物1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）譜（圖2），推斷δ：13.00（1H，s，5-OH），7.92（2H，t，J=8.4 Hz，H-2′，6′），7.52（3H，m，H-3′，4′，5′），6.50（1H，s，H-3），6.24（1H，s，H-8）。以上數(shù)據(jù)與文獻[7]報道的漢黃芩素基本一致，故確定該化合物為漢黃芩素。

圖1 漢黃芩素純度測定液相色譜圖

圖2 漢黃芩素1H-NMR譜

2.2 海南黃芩化學(xué)成分抗腫瘤體外篩選結(jié)果

用IC50計算軟件計算半數(shù)抑制濃度，結(jié)果顯示海南黃芩中漢黃芩素對HepG2、HeLa和A549細胞均顯示顯著的抑制活性，IC50值依次為12.4±3.6、16.8±4.8、17.4±8.6 μmol/L。

2.3 海南黃芩中漢黃芩素體內(nèi)抗腫瘤試驗結(jié)果

2.3.1 腫瘤模型小鼠相對體重隨時間變化曲線從結(jié)果看，實驗期間陰性對照組模型小鼠體重逐步增加，陽性對照組模型小鼠在給予紫杉醇注射液后體重明顯下降，而海南漢黃芩素低、高劑量組小鼠體重呈降低趨勢，與陰性對照組相比存在明顯差異（圖3）。

圖3 腫瘤模型小鼠相對體重隨時間變化曲線

2.3.2 腫瘤模型小鼠隨時間的生存曲線 陰性對照組小鼠在實驗期間無死亡，陽性對照組小鼠在第6、7次給藥后分別死亡1只，而海南漢黃芩素低、高劑量組小鼠均無死亡（圖4）。這與小鼠相對體重曲線相一致，可能系陽性藥紫杉醇注射液毒性大所致。

圖4 腫瘤模型小鼠隨時間的生存曲線

2.3.3 腫瘤模型小鼠相對腫瘤體積隨時間變化曲線 從圖5可見，陰性對照組腫瘤體積隨時間推移明顯增加；與陰性對照組相比，陽性對照組在給予紫杉醇注射液后，腫瘤體積的增加被明顯抑制，尤其在給藥后第4～7 d；低劑量漢黃芩素對小鼠腫瘤體積的增加表現(xiàn)出抑制趨勢，但并不明顯，而高劑量漢黃芩素則明顯抑制腫瘤體積增加，在給藥后第5～7 d差異明顯，呈量-效關(guān)系。

圖5 腫瘤模型小鼠相對腫瘤體積隨時間變化曲線

2.3.4 腫瘤模型小鼠腫瘤重量變化情況 實驗結(jié)束后處死小鼠，取出腫瘤（圖6），稱重。與陰性對照組比較，陽性對照組的腫瘤重量顯著降低，抑制率達57%；海南漢黃芩素低、高劑量組小鼠的腫瘤重量均明顯降低，抑制率分別為24%、54%（表1），且呈現(xiàn)出量-效關(guān)系。

圖6 實驗結(jié)束后腫瘤模型小鼠的腫瘤照片

表1 腫瘤模型小鼠腫瘤重量變化

綜上可見，選取體外抗腫瘤活性顯著、足量成分的海南漢黃芩素，利用小鼠腫瘤動物模型進行在體抗腫瘤作用研究，海南漢黃芩素顯著抑制腫瘤體積和重量，抗腫瘤作用顯著，并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。海南漢黃芩素系具有開發(fā)價值的抗腫瘤先導(dǎo)化合物。

3 討論

我們采用現(xiàn)代分離、分析技術(shù)對海南黃芩中的主要成分進行提取、分離，在確定活性部位的基礎(chǔ)上，分離純化得到具有較強活性成分的漢黃芩素，利用核磁共振等方法確定了其結(jié)構(gòu)。采用肺癌、肝癌、胃癌、宮頸癌等常見腫瘤細胞，利用MTT法測定所分離化合物的細胞毒活性，結(jié)果顯示海南黃芩中的漢黃芩素對HepG2、HeLa和A549細胞均顯示顯著的抑制活性。通過優(yōu)選結(jié)構(gòu)新穎活性顯著的漢黃芩素進行足量制備，并對純度進行測定，應(yīng)用荷瘤動物模型評價漢黃芩素的體內(nèi)抗腫瘤功效。結(jié)果表明海南漢黃芩素顯著抑制腫瘤體積和重量，抗腫瘤作用顯著，并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。

綜上，我們從海黃芩中發(fā)現(xiàn)了極具開發(fā)價值的結(jié)構(gòu)新穎的高效低毒抗腫瘤先導(dǎo)化合物，為形成具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新藥奠定了科學(xué)基礎(chǔ)。