劉潔，李備，劉春，陳露，梁揚(yáng)，周玦飛，陳贊民

1.海南省藥品檢驗(yàn)所，海南 ?？?570216；2.海南省食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，海南 ?？?570311

腫瘤是指機(jī)體在各種致瘤因子作用下，局部組織細(xì)胞增生所形成的新生物，因?yàn)檫@種新生物多呈占位性塊狀突起，也稱贅生物。腫瘤的治療一直是世界難題，盡管市場上有多種藥物，但由于其不良反應(yīng)，導(dǎo)致對(duì)新藥的需求一直處于饑渴狀態(tài)。

唇形科（Labiatae）黃芩屬（Scutellaria）植物資源十分豐富，全世界共有300余種。該屬物種多具有清熱燥濕、瀉火解毒之功效[1-2]。黃芩屬植物具有廣泛的藥理作用，如抗腫瘤、保肝、抗氧化等活性。現(xiàn)代化學(xué)成分研究表明，黃酮和二萜為其主要活性成分[3]。海南黃芩（S.hainanensis）分布于海南地區(qū)，長于石山上，是海南特有植物，具有清熱解毒的功效[4]。我們用多種提取分離技術(shù)獲得黃芩中的漢黃芩素，并利用核磁共振（NMR）等技術(shù)對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定；采用肺癌、肝癌、胃癌、宮頸癌等常見腫瘤細(xì)胞，利用MTT法測(cè)定漢黃芩素的細(xì)胞毒活性；采用S180移植的荷瘤小鼠，對(duì)漢黃芩素進(jìn)行體內(nèi)腫瘤實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明漢黃芩素有很強(qiáng)的抗腫瘤活性，這為深入研究與開發(fā)海南黃芩提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

海南黃芩于2014年8月采自海南省霸王嶺；BLAB/c小鼠（北京維通利華動(dòng)物有限公司）；宮頸癌HeLa細(xì)胞、肝腫瘤HepG2細(xì)胞、肺癌A549細(xì)胞（ATTC）；乳腺癌4T1細(xì)胞（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)所細(xì)胞中心）；紫杉醇（PTX）注射液（?？谑兄扑帍S有限公司）。

Bruker AVⅢ600型核磁共振儀；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；島津LC-10AD二元低壓半制備液相色譜儀；HiChrom Apollo C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；Agilent半制備色譜柱（Phenyl，2.5 mm×25.0 cm，5 μm）；智能生化培養(yǎng)箱（丙林，SPX系列）；島津20A高效液相色譜儀；薄層色譜預(yù)制板（青島海洋化工廠）；柱色譜硅膠（100～200目，200～300目，青島海洋化工廠）；Sephadex LH-20（Healthcare公司）；RPMI 1640完全培養(yǎng)基（Sigma公司）。

1.2 提取黃酮類化合物

干燥粉碎后的海南黃芩（5 kg）用95%乙醇（20 L）冷浸24 h，然后采用加熱回流方式提取，共提取3次，每次2 h。減壓回收溶劑，直至乙醇味消失。母液加水后用石油醚萃取，繼而采用氯仿萃取，濃縮后得到50 g浸膏。

1.3 分離純化黃酮類化合物

將氯仿萃取物進(jìn)行硅膠柱色譜分析，采用氯仿-丙酮梯度洗脫，經(jīng)合并后得到洗脫物Fr.A～Fr.C。Fr.C通過硅膠柱色譜、凝膠柱色譜、反相高效液相制備色譜得漢黃芩素（9.0 mg）。

1.4 測(cè)定黃酮類化合物純度

稱取5個(gè)化合物各約2 mg，精密稱定，分別至100 mL量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，即得供試品。

采用HiChrom Apollo C18色譜柱，流動(dòng)相A為0.3%磷酸，流動(dòng)相B為甲醇∶乙腈=2∶3，流動(dòng)相A∶流動(dòng)相B=40∶60，流速1.0 mL/min，柱溫35℃，進(jìn)樣量20 μL，檢測(cè)波長280 nm。

1.5 核磁測(cè)定方法

采用Bruker AVⅢ600型核磁共振儀，溶劑為DMSO-d6，1H-NMR 為 600 MHz，13C-NMR 為 150 MHz。

1.6 活性成分足量制備

應(yīng)用制備型高效液相色譜、高速逆流色譜或超臨界流體色譜對(duì)活性顯著的化合物漢黃芩素進(jìn)行足量制備，儲(chǔ)備用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的樣品。

1.7 海南黃芩化學(xué)成分的細(xì)胞毒活性評(píng)價(jià)方法

漢黃芩素分別用溶劑DMSO溶解，體外抗腫瘤活性測(cè)定采用MTT法篩選體系，所有樣品的抗腫瘤活性均使用宮頸癌HeLa細(xì)胞、肝腫瘤HepG2細(xì)胞、肺癌A549細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.7.1 細(xì)胞培養(yǎng) 常規(guī)方法培養(yǎng)，在底面積為25 cm2的培養(yǎng)瓶中加入RPMI1640完全培養(yǎng)基，含10%體積的新生牛血清、100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素。細(xì)胞于37℃、5%CO2，相對(duì)濕度100%的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每日觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，對(duì)生長密度超過80%瓶底面積的細(xì)胞進(jìn)行消化傳代。消化液用0.25%胰酶-0.02%EDAT，每次傳代比例1∶3，以保證細(xì)胞一直處于對(duì)數(shù)生長期。

1.7.2 細(xì)胞接板 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，按5000～8000/孔接入96孔板，培養(yǎng)24 h后加藥。

1.7.3 藥物處理 用完全培養(yǎng)基梯度稀釋藥液，過濾除菌，加入96孔板中，200 μL/孔。每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置6個(gè)空白對(duì)照孔（僅含完全培養(yǎng)基），藥物濃度組設(shè)置1∶100、1∶500、1∶1000共3個(gè)梯度，每個(gè)梯度3個(gè)復(fù)孔。

1.7.4 MTT處理 將MTT溶于0.01 mol/L（pH7.4）的PBS緩沖液中，配成終濃度為5 mg/mL的溶液，0.22 μm濾膜過濾除菌。藥物作用48 h后棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，加MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去MTT溶液，PBS洗滌2次，用20 μL DMSO裂解細(xì)胞，溶解甲攢化合物。

1.7.5 測(cè)定及計(jì)算 用IC50計(jì)算軟件計(jì)算半數(shù)抑制濃度。

1.8 海南黃芩中漢黃芩素體內(nèi)抗腫瘤試驗(yàn)

1.8.1 腫瘤動(dòng)物模型的建立 BALB/c小鼠，雌性，體重20±1 g，實(shí)驗(yàn)前飼養(yǎng)觀察1周。培養(yǎng)4T1細(xì)胞至對(duì)數(shù)期，胰酶消化，用無菌生理鹽水調(diào)整瘤細(xì)胞懸液濃度為1×106/mL，備用。BALB/c小鼠右腋下注射0.2 mL 4T1細(xì)胞懸液，腫瘤生長至第7 d，體積達(dá)到約100 mm3，篩選腫瘤大小相對(duì)一致的小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.8.2 動(dòng)物模型分組及給藥 選擇上述腫瘤模型動(dòng)物32只，隨機(jī)分成4組，陰性與陽性對(duì)照組每組10只，藥物組每組6只。陰性對(duì)照組給予生理鹽水，陽性對(duì)照組尾靜脈注射10 mg/kg[5]市售紫杉醇（PTX）注射液；通過查閱文獻(xiàn)[6]及預(yù)實(shí)驗(yàn)，藥物低劑量組、藥物高劑量組分別灌胃給予10、40 mg/kg海南漢黃芩素，連續(xù)7 d。

1.8.3 藥效學(xué)指標(biāo)考察 每次給藥時(shí)稱量小鼠體重，用游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠腫瘤體積，每日觀察小鼠毛發(fā)、活動(dòng)、睡眠及死亡等一般狀況。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，脫臼處死小鼠，完整剝離腋下腫瘤組織，稱瘤重，計(jì)算抑瘤率（%）=（1-治療組平均瘤重/陰性對(duì)照組平均瘤重）×100%。

2 結(jié)果

2.1 漢黃芩素結(jié)構(gòu)鑒定

化合物為無色油狀物，HPLC歸一化法測(cè)得純度為97.1%（圖1）。根據(jù)化合物1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）譜（圖2），推斷δ：13.00（1H，s，5-OH），7.92（2H，t，J=8.4 Hz，H-2′，6′），7.52（3H，m，H-3′，4′，5′），6.50（1H，s，H-3），6.24（1H，s，H-8）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報(bào)道的漢黃芩素基本一致，故確定該化合物為漢黃芩素。

圖1 漢黃芩素純度測(cè)定液相色譜圖

圖2 漢黃芩素1H-NMR譜

2.2 海南黃芩化學(xué)成分抗腫瘤體外篩選結(jié)果

用IC50計(jì)算軟件計(jì)算半數(shù)抑制濃度，結(jié)果顯示海南黃芩中漢黃芩素對(duì)HepG2、HeLa和A549細(xì)胞均顯示顯著的抑制活性，IC50值依次為12.4±3.6、16.8±4.8、17.4±8.6 μmol/L。

2.3 海南黃芩中漢黃芩素體內(nèi)抗腫瘤試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 腫瘤模型小鼠相對(duì)體重隨時(shí)間變化曲線從結(jié)果看，實(shí)驗(yàn)期間陰性對(duì)照組模型小鼠體重逐步增加，陽性對(duì)照組模型小鼠在給予紫杉醇注射液后體重明顯下降，而海南漢黃芩素低、高劑量組小鼠體重呈降低趨勢(shì)，與陰性對(duì)照組相比存在明顯差異（圖3）。

圖3 腫瘤模型小鼠相對(duì)體重隨時(shí)間變化曲線

2.3.2 腫瘤模型小鼠隨時(shí)間的生存曲線 陰性對(duì)照組小鼠在實(shí)驗(yàn)期間無死亡，陽性對(duì)照組小鼠在第6、7次給藥后分別死亡1只，而海南漢黃芩素低、高劑量組小鼠均無死亡（圖4）。這與小鼠相對(duì)體重曲線相一致，可能系陽性藥紫杉醇注射液毒性大所致。

圖4 腫瘤模型小鼠隨時(shí)間的生存曲線

2.3.3 腫瘤模型小鼠相對(duì)腫瘤體積隨時(shí)間變化曲線 從圖5可見，陰性對(duì)照組腫瘤體積隨時(shí)間推移明顯增加；與陰性對(duì)照組相比，陽性對(duì)照組在給予紫杉醇注射液后，腫瘤體積的增加被明顯抑制，尤其在給藥后第4～7 d；低劑量漢黃芩素對(duì)小鼠腫瘤體積的增加表現(xiàn)出抑制趨勢(shì)，但并不明顯，而高劑量漢黃芩素則明顯抑制腫瘤體積增加，在給藥后第5～7 d差異明顯，呈量-效關(guān)系。

圖5 腫瘤模型小鼠相對(duì)腫瘤體積隨時(shí)間變化曲線

2.3.4 腫瘤模型小鼠腫瘤重量變化情況 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死小鼠，取出腫瘤（圖6），稱重。與陰性對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組的腫瘤重量顯著降低，抑制率達(dá)57%；海南漢黃芩素低、高劑量組小鼠的腫瘤重量均明顯降低，抑制率分別為24%、54%（表1），且呈現(xiàn)出量-效關(guān)系。

圖6 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后腫瘤模型小鼠的腫瘤照片

表1 腫瘤模型小鼠腫瘤重量變化

綜上可見，選取體外抗腫瘤活性顯著、足量成分的海南漢黃芩素，利用小鼠腫瘤動(dòng)物模型進(jìn)行在體抗腫瘤作用研究，海南漢黃芩素顯著抑制腫瘤體積和重量，抗腫瘤作用顯著，并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。海南漢黃芩素系具有開發(fā)價(jià)值的抗腫瘤先導(dǎo)化合物。

3 討論

我們采用現(xiàn)代分離、分析技術(shù)對(duì)海南黃芩中的主要成分進(jìn)行提取、分離，在確定活性部位的基礎(chǔ)上，分離純化得到具有較強(qiáng)活性成分的漢黃芩素，利用核磁共振等方法確定了其結(jié)構(gòu)。采用肺癌、肝癌、胃癌、宮頸癌等常見腫瘤細(xì)胞，利用MTT法測(cè)定所分離化合物的細(xì)胞毒活性，結(jié)果顯示海南黃芩中的漢黃芩素對(duì)HepG2、HeLa和A549細(xì)胞均顯示顯著的抑制活性。通過優(yōu)選結(jié)構(gòu)新穎活性顯著的漢黃芩素進(jìn)行足量制備，并對(duì)純度進(jìn)行測(cè)定，應(yīng)用荷瘤動(dòng)物模型評(píng)價(jià)漢黃芩素的體內(nèi)抗腫瘤功效。結(jié)果表明海南漢黃芩素顯著抑制腫瘤體積和重量，抗腫瘤作用顯著，并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。

綜上，我們從海黃芩中發(fā)現(xiàn)了極具開發(fā)價(jià)值的結(jié)構(gòu)新穎的高效低毒抗腫瘤先導(dǎo)化合物，為形成具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新藥奠定了科學(xué)基礎(chǔ)。