(徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院,江蘇徐州,221006)

隨著世界經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，人們?nèi)找嬖鲩L(zhǎng)的物質(zhì)需求和逐漸枯竭的能源以及環(huán)境的惡化形成尖銳矛盾。十九大之后，習(xí)總書記提出，“綠水青山就是金山銀山”。潔凈能源的開發(fā)與利用不僅可以緩解能源危機(jī)，也是實(shí)現(xiàn)環(huán)境優(yōu)化的必經(jīng)之路[3]。目前，在潔凈能源的研究中，生物質(zhì)能源作為可再生能源深受青睞。而在生物質(zhì)能源的研究中，農(nóng)作物秸稈是熱點(diǎn)。然而農(nóng)作物秸稈人們可利用的物質(zhì)主要為纖維素。而纖維素與木質(zhì)素等緊密相連，其結(jié)構(gòu)難以破壞，因此不易被酶解，且酶解還原糖產(chǎn)量較少生產(chǎn)成本高，所以目前的秸稈綜合利用率不高[2]。浮萍是一種水面浮生植物。當(dāng)氣候炎熱潮濕，其生長(zhǎng)迅速，多見于水田、池塘等靜水水域。浮萍中淀粉含量豐富，但由于其極易吸收重金屬、有機(jī)物等組分，因此不宜食用，也不宜作飼料使用。因此，浮萍是制備燃料酒精的最佳選擇[4]。而欲制備燃料酒精，必先水解其淀粉使其成為還原糖。本文采用微波預(yù)處理，主要考察微波預(yù)處理時(shí)間、微波功率、固液比對(duì)酶解產(chǎn)生還原糖濃度的影響，并利用響應(yīng)面法進(jìn)行了工藝優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與器材

1.1.1 實(shí)驗(yàn)原料與器材

浮萍(徐州三環(huán)西路高架橋附近，打撈后進(jìn)行烘干處理)；淀粉酶；Sartorius電子天平；水浴鍋(星羅棋布公司)；微波爐(格力公司)；吸光光度計(jì)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

1.1.2.1 DNS溶液的制備

稱取6.3g DNS和63mL的2mol/L的NaOH溶液，加入500mL去離子水(含有182g酒石酸鉀鈉)的溶液中，攪拌均勻，之后加入5g重蒸酚和5g亞硫酸鈉，攪拌使其溶解，冷卻后加水定容至1000mL，低溫保存于棕色瓶中[1]。

1.1.2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱取干燥恒重的葡萄糖0.5g，經(jīng)少量水溶解后加3mL 12mol/L的濃硫酸，以去離子水定容至1000mL，即為500mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 還原糖濃度的測(cè)定

1.2.1.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取6支試管，按表1的順序加入各種試劑。加入純凈水振蕩后，在540nm下檢測(cè)，以1號(hào)管為空白管，記錄吸光度A為540nm，橫坐標(biāo)為吸光度，縱坐標(biāo)為葡萄糖濃度，所擬合的曲線R值為0.9995，擬合度良好[1]。

1.2.1.2 還原糖濃度的測(cè)定步驟

從經(jīng)過處理的浮萍中分別精密稱取(0.5±0.01)g加入對(duì)應(yīng)編號(hào)試管中，用移液管移取配制好的纖維素酶溶液2.5 mL，再加入pH值4.8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液25mL，混合均勻。50℃下，將上述混合溶液150 r/min振蕩進(jìn)行催化反應(yīng)1 h后，置于沸水浴2min終止酶解反應(yīng)，并濾紙過濾，之后迅速進(jìn)行還原糖濃度的測(cè)定。用DNS法測(cè)定還原糖濃度(CRed)，并以此代表酶解效果[1]。

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定方法

1.2.1.3 還原糖濃度的測(cè)定方法

先將試管放入沸水浴中 2 min，目的是使酶失活，接著吸取0.5 mL待測(cè)液加入試管中，加入DNS溶液1mL于沸水中水浴5 min后冷卻，再加入8 mL蒸餾水，測(cè)定其吸光度，通過對(duì)照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，查出還原糖含量(mg)。如果待測(cè)液濃度超過標(biāo)準(zhǔn)曲線最大吸光度，則稀釋一定倍數(shù)后再測(cè)[1]。

1.2.2 微波處理浮萍的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)考察

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中變量與編碼

1.2.2.1 微波加熱時(shí)間對(duì)微波處理的影響

在固液比1∶30，微波功率380 W時(shí)，將微波時(shí)間分別設(shè)置為2 min，4 min，6 min，8 min，10 min進(jìn)行加熱，結(jié)果見圖1。

圖1 微波加熱時(shí)間對(duì)微波處理的影響

由圖1可以看出當(dāng)微波功率固定為380 W時(shí)，酶解還原糖濃度最高是在6 min。微波加熱時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)酶解還原糖濃度都有影響。

1.2.2.2 微波功率對(duì)微波處理的影響

在固液比1∶30，微波加熱時(shí)間6 min時(shí)，將微波功率分別設(shè)置為190 W，380 W，570 W，760 W，950 W進(jìn)行加熱，結(jié)果見圖2。

圖2 微波功率對(duì)微波處理的影響

由圖2可以看出，當(dāng)微波加熱時(shí)間固定在6 min時(shí)，酶解還原糖濃度最高是在380 W。微波功率對(duì)酶解還原糖濃度影響較大，過高的功率會(huì)使酶解效率大大降低。

1.2.2.3 固液比對(duì)微波處理的影響

把不同固液比的浮萍固定其微波功率380 W，微波加熱時(shí)間6 min做處理，結(jié)果見圖3。

圖3 固液比對(duì)微波處理的影響

由圖3可以看出，當(dāng)固定微波功率380 W，加熱時(shí)間6 min時(shí)，酶解還原糖濃度最高是在1∶30。且由圖表的變化趨勢(shì)可以得出以下結(jié)論：固液比對(duì)酶解還原糖的影響比微波加熱時(shí)間和微波加熱功率小得多。

2 微波處理浮萍的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)

2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken Design(BBD)設(shè)計(jì)原則，選取微波加熱時(shí)間、固液比、微波功率3個(gè)對(duì)微波處理影響較顯著的因素,以還原糖濃度(g/mL)為響應(yīng)值，得到的試驗(yàn)數(shù)據(jù)詳見表3。

表3 浮萍微波處理響應(yīng)面分析結(jié)果

2.2 二元多次回歸模型分析

運(yùn)用Design-Expert軟件對(duì)表三的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，最終得到二次多元回歸方程(Y為還原糖濃度)：

Y=24.41+1.15*A+0.44*B-0.37*C-3.75*AB-0.20*AC+2.500E-003*BC-2.36*A2-2.83*B2-1.09*C2。

表4 浮萍響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)中微波處理的分析結(jié)果

圖4 微波加熱時(shí)間和微波功率對(duì)還原糖濃度的影響

圖5 微波加熱時(shí)間和固液比對(duì)還原糖濃度的影響

圖6 固液比和微波功率對(duì)還原糖濃度的影響

運(yùn)用Design-Expert軟件，進(jìn)行二元多次模擬，得到二元回歸方程的等高線和響應(yīng)面(圖4-6).從圖4-6中可以看出，3個(gè)因素的交互作用對(duì)還原糖濃度影響顯著，F(xiàn)值可以判斷各個(gè)因素對(duì)還原糖濃度的影響程度，F(xiàn)值越大影響程度越顯著。根據(jù)表3和圖4-6可以判斷微波加熱時(shí)間與微波功率對(duì)實(shí)驗(yàn)影響最大。不同的微波加熱時(shí)間得到的最高還原糖濃度所對(duì)應(yīng)的微波功率也不一樣。根據(jù)本文三個(gè)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響可以判斷和確定最佳實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：微波加熱時(shí)間5.64 min，微波功率350W，固液比1∶30，還原糖濃度在24.76 mg/mL。比普通實(shí)驗(yàn)提取還原糖的效率高了9.83%。

3 結(jié)論

本文研究了浮萍的預(yù)處理，利用響應(yīng)面法對(duì)微波處理浮萍進(jìn)行了工藝優(yōu)化，并找出了顯著性因素[2]。研究發(fā)現(xiàn)微波功率和微波加熱時(shí)間協(xié)同作用下，微波功率過高會(huì)破壞浮萍的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，微波溫度過高或過低都會(huì)使酶解反應(yīng)速率變慢，本實(shí)驗(yàn)中微波加熱6 min，微波功率380 W時(shí)是實(shí)驗(yàn)的最佳處理數(shù)據(jù)，微波處理的功率既不會(huì)破壞浮萍的結(jié)構(gòu)又能極快處理干燥浮萍。適宜的溫度也能使酶解效果達(dá)到最佳。此時(shí)，還原糖濃度在24-30mg/mL之間，相比較微波處理纖維素的還原糖濃度高得多。為下一步制備燃料酒精提供基礎(chǔ)。