張 華，邱 鎮(zhèn)，陳 紅,陳衛(wèi)東△

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，合肥 230012；2.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院/中藥資源保護(hù)與開發(fā)研究所，合肥 230012；3.馬鞍山十七冶醫(yī)院,安徽馬鞍山 243000)

高血壓作為臨床常見慢性疾病之一，是引起心腦血管疾病的一個主要因素。我國高血壓發(fā)病率明顯上升，成為世界上高血壓危害最嚴(yán)重的國家[1]。硝苯地平是一類長效鈣通道阻滯劑，對血壓控制效果良好，是高血壓患者臨床治療的首選藥物之一[2-3]。丹參是唇形科植物丹參的干燥根和根莖，最初記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，丹參具有擴(kuò)張冠狀動脈、防止心肌缺血和心肌梗死、改善微循環(huán)、降低心肌耗氧量等作用，在臨床上，廣泛用于心腦血管疾病的治療[4-5]。另外丹參粉具有消除氧自由基、提高一氧化氮(NO)合成釋放、提高纖溶活性的作用，可改善患者病情，減少靶器官損害及并發(fā)癥的發(fā)生[6]。但二者聯(lián)合使用在心血管疾病的治療中是否能產(chǎn)生有益的影響，或者說二者之間有無協(xié)同作用，國內(nèi)尚無相關(guān)研究報道。

1 材料與方法

1.1實驗動物 24只健康SD大鼠[由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供；清潔級，合格證號為SCXK(皖)2011-002]，體質(zhì)量(220±10)g。飼養(yǎng)條件：溫度為(20±2)℃，濕度為(50±5)%，每天12 h光照。適應(yīng)性飼養(yǎng)2周，自由飲食，進(jìn)水。實驗前禁食12 h，自由飲水。

1.2儀器與試劑 LC-15C高效液相色譜儀(日本島津)，AB135-S 型十萬分之一電子天平(德國梅特勒-托利多儀器有限公司)，XW-80A微型渦旋混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)，KQ-300B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，TG16-WS臺式高速離心機(jī)(長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)，LC-4016型低速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)，BCD-225CHC冰箱(合肥美菱股份有限公司)。硝苯地平對照品購自中國食品藥品檢定研究院(純度大于99.9%，批號100338-201103)，地西泮對照品購自西安萬昌生物科技有限公司(純度大于99%，批號D-104140403)。 硝苯地平片購自南京白敬宇制藥有限責(zé)任公司(批號151101；每片10 mg)，丹參凍干粉針劑購自哈藥集團(tuán)中藥二廠(批號1601768；400 mg/支)。 甲醇購自上海信可有限公司(色譜純)，超純水為安徽中醫(yī)藥大學(xué)自制(18.2 Ω)。

1.3方法

1.3.1色譜條件 色譜柱COSMOSIL C18柱(4.6×250 mm，5 mm)，檢測波長235 nm。流動相(B)甲醇-(A)水(55∶45，V/V)，在線脫氣，等度洗脫。流速為1.0 mL/min，柱溫箱設(shè)置溫度為30 ℃，進(jìn)樣定量環(huán)為20 μL。

1.3.2給藥方案及血漿樣品采集 按體質(zhì)量分成4組，每組6只。從實驗第1天到第6天對4組分別進(jìn)行不同的給藥預(yù)處理。對照組：尾靜脈注射生理鹽水；丹參粉針低劑量組：尾靜脈注射20 mg/kg丹參粉針；丹參粉針中劑量組：尾靜脈注射40 mg/kg丹參粉針；丹參粉針高劑量組：尾靜脈注射80 mg/kg丹參粉針。末次給藥后，禁食12 h，自由飲水。實驗第7天，各組大鼠按上述劑量給藥后，立即灌服硝苯地平10 mg/kg。于給藥后0.05、0.083、0.167、0.25、0.5、0.75、1、2、4、8、12、24 h由大鼠眼眥取血0.3 mL，立即置于肝素化EP管中，搖勻，3 500 r/min離心10 min以分離血漿，-20 ℃保存，備測。

1.3.3血漿樣品處理 精密移取大鼠血漿90 μL，將其置于1.5 mL具塞離心管中，加入10 μL內(nèi)標(biāo)地西泮(濃度為7.76 μg/mL，用甲醇溶解)，再精密加入300 μL甲醇(蛋白沉淀劑)，置渦旋混合儀上渦旋振蕩3 min，混勻后，置于低速離心機(jī)中3 500 r/min離心10 min，取全部上清液，過0.22 μm微孔濾膜，取上清液進(jìn)樣分析。采用內(nèi)標(biāo)法，目標(biāo)峰與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值進(jìn)行定量分析。

2 結(jié) 果

2.1專屬性考察 取大鼠的供試品、對照品及內(nèi)標(biāo)溶液分別按照“1.3.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，用來考察內(nèi)標(biāo)地西泮以及血漿的內(nèi)源性雜質(zhì)是否干擾硝苯地平的測定。結(jié)果表明，硝苯地平的保留時間為16.7 min，內(nèi)標(biāo)地西泮的保留時間為7 min，各色譜峰峰形較好，色譜峰分離度良好，且空白血漿中的內(nèi)源性雜質(zhì)及內(nèi)標(biāo)地西泮在此條件下沒有干擾硝苯地平的測定。供試品中硝苯地平與對照品中的硝苯地平的保留時間相同，說明該條件特異性較強(qiáng)，方法專屬性較高。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 精密吸取不同濃度的硝苯地平標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加入內(nèi)標(biāo)和空白血漿，配制成含硝苯地平0.8，1.6，3.2，6.4，12.8，25.6，51.2 μg/mL的血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“1.3.3”項下方法處理樣品，以血藥濃度(p)為橫坐標(biāo)，硝苯地平與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值( Y) 為縱坐標(biāo)，建立回歸方程，求得硝苯地平的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.083 6X+0.073 6，R2=0.998 8，所得結(jié)果表明硝苯地平線性范圍為0.8～51.2 μg/mL，且線性關(guān)系良好，定量下限(LLOQ)為0.8 g/mL。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 血漿中硝苯地平的標(biāo)準(zhǔn)曲線(n=7)

2.3精密度與回收率 精取硝苯地平對照液(0.8、1.6、6.4 和38.0 μg/mL)，配制成LLOQ、低、中、高4個濃度的質(zhì)控樣本溶液，分別按照“1.3.3”方法進(jìn)樣分析。每個濃度平行6個樣本，連續(xù)測定3 d(每天重新配制樣品)，計算日內(nèi)和日間精密度(表1)。

2.4穩(wěn)定性 按“1.3.3”項下方法配制LLOQ、低中高(0.8、1.6、6.4 和38.0 μg/mL)4個質(zhì)量濃度的硝苯地平血漿樣品，考察血樣在室溫條件下于0、2、4、8、12、24 h內(nèi)放置的穩(wěn)定性。另外還考察放置于-20 ℃冰箱凍存，先后兩次將血漿樣品取出的血漿樣品穩(wěn)定性。各條件下每一濃度平行6份，經(jīng)測定各濃度的RSD值均小于10%。說明上述條件下各血漿樣品穩(wěn)定性良好。

2.5藥動學(xué)參數(shù)分析

2.5.1血藥濃度-時間曲線 根據(jù)所得的血藥濃度數(shù)據(jù)結(jié)果，繪制各組血藥濃度-時間曲線；使用DAS 2.0軟件對所測得各血藥濃度數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，其參數(shù)結(jié)果如圖2所示。

2.5.2統(tǒng)計矩參數(shù) 從藥時曲線結(jié)果可知，聯(lián)合使用的中劑量組曲線上的點均大于對照組的濃度，且丹參凍干粉針劑對大鼠體內(nèi)硝苯地平的血藥濃度是增加的。從上表可以看出低劑量、中劑量、高劑量實驗組的平均駐留時間[MRT(0→∞)]分別為685.363±192.728、799.976±394.869、599.533±127.471，各實驗組均明顯大于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05；P<0.01)，見表2。

圖2 藥時曲線

標(biāo)示濃度(μg/mL)日內(nèi)平均值(x±s)RSD(%)日間平均值(x±s)RSD(%)0.80.813±0.0202.440.803±0.15319.101.61.579±0.0704.451.611±0.17310.766.46.406±0.82512.886.383±0.4687.3338.037.825±0.5671.5038.482±3.6129.39

表2 大鼠的統(tǒng)計距參數(shù)

*：P<0.05;*：P<0.01,與對照組比較

3 討 論

根據(jù)藥典可知，硝苯地平為疏水性成分，甲醇、乙腈是蛋白沉淀法常用的有機(jī)溶劑，用甲醇的優(yōu)點是上清液澄清,沉淀為絮狀且易于分離，血漿雜質(zhì)峰少，重現(xiàn)性好[7-9]，故選用操作簡便、對操作者傷害小、成本較低、適合于大批量生物樣品處理的蛋白沉淀法對血漿生物樣品進(jìn)行前處理[10-11]。

本實驗采用常用的流動相甲醇-水，并以甲醇-水(55∶45)作為使用比例，根據(jù)文獻(xiàn)[12-14]流動相甲醇-水(60∶40)的參考，又因甲醇-水(50∶50)沖洗柱子出峰時間快，但黏度大、避免使用，綜合考慮樣品出峰時間和安全性問題，最終確定以甲醇-水(55∶45)比例制備流動相。

根據(jù)內(nèi)標(biāo)物選擇的要求，因為地西泮具有鎮(zhèn)靜、抗焦慮和一定的抗心律失常作用，能有效改善硝苯地平體位性低血壓的不良反應(yīng)[15]，結(jié)合樣品出峰時間的考慮，地西泮出峰時間較早，總分析時間僅7 min，優(yōu)化了整體出峰時間，本實驗確定用地西泮作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。

通過硝苯地平聯(lián)合丹參凍干粉針用藥的實驗組(丹參低劑量組、臨床等效量組、高劑量組)與對照組對比，發(fā)現(xiàn)實驗組MRT(0→∞)數(shù)值均高于生理鹽水組，表明丹參可以增加硝苯地平在體內(nèi)的平均駐留時間。MRT是藥物在體內(nèi)的平均駐留時間，靜脈推注一定量藥物后，藥物分子分布于全身各處，這些藥物分子于體內(nèi)滯留時間不等[16]。平均駐留時間是一個總體行為的特征，它是每一個分子滯留時間的平均值，也是非常重要的藥動學(xué)參數(shù)[17]。本實驗聯(lián)合丹參凍干粉針劑使用的實驗組的MRT(0→∞)均較對照組有顯著增加，可能減慢硝苯地平的體內(nèi)消除，對硝苯地平的代謝可能具有一定的抑制作用。

通過實驗組t1/2z數(shù)值的比較，發(fā)現(xiàn)高劑量組t1/2z數(shù)值明顯低于中、低劑量組，可能是過高濃度的丹參溶液會誘導(dǎo)硝苯地平在體內(nèi)的代謝。后期可能還需要從能夠影響硝苯地平體內(nèi)消除過程的其他代謝酶或轉(zhuǎn)運蛋白角度設(shè)計進(jìn)一步的實驗，以期可以闡明丹參凍干粉針劑對大鼠體內(nèi)硝苯地平消除過程產(chǎn)生影響的機(jī)制。

本實驗建立了靈敏檢測大鼠體內(nèi)硝苯地平的血漿生物樣品分析方法——HPLC法，該方法符合生物樣品分析要求。在實驗中實驗方法的確立、樣品的處理、試劑與樣品的穩(wěn)定性實驗等操作，體現(xiàn)了實驗的嚴(yán)謹(jǐn)、消除了存放時間、貯存溫度對實驗結(jié)論的影響。

本實驗以不同劑量丹參凍干粉針劑對硝苯地平影響，所得血藥濃度作比較，對聯(lián)合用藥時丹參凍干粉針對硝苯地平的藥動學(xué)參數(shù)的影響進(jìn)行了初步研究。在多次給藥中建立了連續(xù)7 d注射不同劑量丹參的3個實驗組及注射生理鹽水的對照組。結(jié)果顯示在聯(lián)合使用丹參凍干粉針時實驗組大鼠體內(nèi)硝苯地平的平均駐留時間均有所提高，具體為低、中、高劑量組的MRT(0→∞)與對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但實驗組其他藥動學(xué)參數(shù)與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。