管淑紅,王智剛,朱煜明,徐乾乾,周 軍
(江蘇省常州市第一人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科 213000)
特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)本質(zhì)為原因不清楚的間質(zhì)性肺炎,主要表現(xiàn)為肺間質(zhì)的纖維化,以往研究認為該病尚無特效藥物治療和改善預(yù)后[1]。隨著對該病的重視,越來越多的新藥涌現(xiàn)出來,2015版IPF治療指南依據(jù)一些新藥研究證據(jù),對吡非尼酮和尼達尼布這兩種藥物進行了有條件推薦[2]。鑒于我國的國情,IPF患者通常面臨經(jīng)濟成本、依從性等挑戰(zhàn),從這兩種藥物中獲益甚少。
柴胡皂甙具有抗病毒、抗炎、抗肝腎等器官纖維化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、治療腎炎等作用,其中最具有活性的成分是柴胡皂甙D(SSD) 。本課題組致力于研究SSD對肺纖維化的干預(yù)作用及機制,早期部分動物體內(nèi)外實驗已證實SSD能通過保護肺泡上皮細胞免于過度凋亡、抑制成纖維細胞增殖等機制緩解肺纖維化病情[3],本文將系列報道SSD對肺纖維化小鼠上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的干預(yù)作用及機制研究。
1.1實驗動物及分組 所有實驗小鼠均購自揚州大學實驗動物中心,均為清潔級6周,體質(zhì)量為18~22 g,雄性昆明種,總共60只。采用隨機數(shù)字表法將60只小鼠分為3組:對照組、博來霉素(BLM)組及SSD組,各20只。BLM組和SSD組通過文獻[4]方法制備肺纖維化模型,均給予氣管內(nèi)注入濃度為5 mg/kg的 BLM溶液,并通過旋轉(zhuǎn)的方式保證藥物充分分布在肺內(nèi),術(shù)后常規(guī)喂養(yǎng)。而對照組則給予相同體積0.9%的氯化鈉。配置SSD溶液方法如下:將SSD 20 mg溶入二甲基亞砜(DMSO)3 mL中,用生理鹽水稀釋至100 mL,避光保存,SSD組每日腹腔內(nèi)注入SSD溶液(2.0 mg/kg),BLM組和對照組每日同等條件下腹腔內(nèi)注入0.2 mL生理鹽水+DMSO(3 mL DMSO 溶于97 mL生理鹽水),連續(xù)28 d。
1.2方法
1.2.1標本收集 在用藥后的第14、28天,各組隨機選取10只實驗小鼠,均取出其肺組織,右肺組織保存于-70 ℃冰箱,用于檢測E鈣黏蛋白、抗纖維連接蛋白、Wnt蛋白和β-actenin蛋白的表達;左肺完整置于4%多聚甲醛溶液中固定,用于HE染色。
1.2.2病理切片觀察 將多聚甲醛固定后的左肺組織用石蠟包埋,切片后給予蘇木素-伊紅(HE)染色,然后通過光鏡下觀察肺組織的損傷程度和膠原纖維的變化,采用SZAPIEL等[5]研究分級。肺泡炎:0級為無肺泡炎癥;Ⅰ級為輕度肺泡炎,有少量炎癥細胞浸潤;Ⅱ級為中度肺泡炎;Ⅲ級為重度肺泡炎,病變彌漫。肺纖維化:0級為無或少量膠原纖維;Ⅰ級為膠原纖維輕度增多;Ⅱ級為膠原纖維中度增多,可伴有肺泡結(jié)構(gòu)紊亂;Ⅲ級為膠原纖維明顯增多,肺泡塌陷、融合、結(jié)構(gòu)紊亂。肺泡炎及肺纖維化等級資料分別記為1~4分。
1.2.3Western blot檢測肺組織E鈣黏蛋白、纖維連接蛋白、Wnt蛋白、β-actenin蛋白表達 100 mg組織加1 mL RIPA裂解液于玻璃勻漿器中研磨、裂解。離心后加入2×十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液,煮沸后于10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)中恒壓90 V電泳2 h,采用5%脫脂奶粉封閉1 h,一抗2 h,二抗1 h,用顯色劑ECL-plus染色最后在Typhoon掃描儀中成像,采用Imagequant TL軟件分析光密度值。
2.1肺組織病理學觀察 光鏡下觀察,對照組肺結(jié)構(gòu)正常,未見炎性細胞浸潤(圖1A)。BLM組第14天炎性細胞明顯浸潤,肺泡間隔明顯增寬(圖1B);第28天肺組織結(jié)構(gòu)破壞,部分肺泡塌陷融合,其間可見炎性細胞浸潤,見大量寬帶狀及片狀膠原纖維,呈彌漫性肺纖維化(圖1C)。SSD組肺泡炎及肺纖維化程度較同期BLM組均明顯減輕(圖1D和 1E)。各組小鼠肺泡炎和肺纖維化程度的定量分析結(jié)果見表1。對照組第14和28 天肺泡炎和肺纖維化程度評分比較無明顯差異,其余各組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其中,SSD組和BLM組肺泡炎及肺纖維化程度評分均高于同期對照組(P<0.05),且SSD組低于同期BLM組(P<0.05)。
2.2Western blot檢測肺組織E鈣黏蛋白、纖維連接蛋白表達 在造模第14和28天,Western blot檢測肺組織E鈣黏蛋白表達顯著下調(diào)(P<0.05),而纖維連接蛋白表達則顯著上調(diào)(P<0.05)。同期相比,SSD組和BLM組E鈣黏蛋白的表達均低于對照組(P<0.05),且SSD組高于BLM組(P<0.05);同期相比,SSD組和BLM組纖維連接蛋白的表達均高于對照組(P<0.05),且SSD組低于BLM組(P<0.05),見圖2~4。
表1 各組小鼠給藥后肺泡炎和肺纖維化程度評分比較分)
a:P<0.05,b:P<0.01,與對照組比較;c:P<0.05,d:P<0.01,與BLM組比較
A:對照組第28天;B:BLM組第14天;C:BLM組第28天;D:SSD組第14天;E:SSD組第28天
圖1各組小鼠給藥后不同時間肺組織病理形態(tài)變化(HE,×200)
圖2 E鈣黏蛋白和纖維連接蛋白的Western blot
*:P<0.05,與第14天比較;◇:P<0.05,與同期對照組比較;▽:P<0.05,與同期SSD組比較
圖3 E鈣黏蛋白表達的相對灰度值比較
*:P<0.05,與第28天比較;◇:P<0.05,與同期對照組比較;▽:P<0.05,與同期BLM組比較
圖4纖維連接蛋白表達的相對灰度值比較
圖5 Wnt蛋白和β-actenin蛋白的Western blot電泳圖
*:P<0.05,與第28天比較;◇:P<0.05,與同期對照組比較;▽:P<0.05,與同期BLM組比較
圖6 Wnt蛋白表達的相對灰度值比較
*:P<0.05,與第28天比較;◇:P<0.05,與同期對照組比較;▽:P<0.05,與同期BLM組比較
圖7 β-actenin蛋白表達的相對灰度值比較
2.3Western blot檢測肺組織Wnt蛋白、β-actenin蛋白表達 在造模第14和28天,Western blot檢測肺組織Wnt蛋白、β-actenin蛋白表達均顯著上調(diào)(P<0.05)。同期相比,SSD組和BLM組Wnt蛋白、β-actenin蛋白的表達均高于對照組(P<0.05),且SSD組低于BLM組(P<0.05),見圖5~7。
IPF的發(fā)病受多種因素影響,主要包括炎癥導(dǎo)致的組織損失和組織損傷后的修復(fù)疊加等。CHINLOSI等[6]通過免疫組織化學染色研究了20例IPF患者的肺活檢標本,其中在18例患者的增殖性細支氣管損害局灶發(fā)現(xiàn)了胞核內(nèi)Wnt途徑靶基因產(chǎn)物cyclinD1、β-catenin和基質(zhì)金屬蛋白酶等的表達,表明IPF的發(fā)病與Wnt途徑的活化有關(guān);同時,該研究在其他類型的間質(zhì)性肺病(inter stitial lung disease,ILD)患者的標本中均沒有檢測到胞核內(nèi)Wnt途徑相關(guān)分子表達的改變,表明Wnt途徑的活化僅限于IPF。此外,研究還顯示W(wǎng)nt途徑的活化在EMT中具有重要的作用,導(dǎo)入Wnt-1基因可以增高MDCK和HCE等上皮細胞系細胞胞質(zhì)內(nèi)β-catenin的表達,促使淋巴樣增強因子1(LEF1)轉(zhuǎn)入胞核內(nèi),進而引發(fā)輕微的EMT;DLD-1上皮腫瘤細胞導(dǎo)入LEF-1基因后,其胞核內(nèi)β-catenin呈現(xiàn)穩(wěn)定的高表達,導(dǎo)致顯著EMT的發(fā)生,因此EMT過程具有可逆性[7]。但是,Wnt途徑的活化在EMT過程中的作用及其在IPF發(fā)病中對肺內(nèi)細胞和分子的影響需要進行更進一步的研究[8]。
本文對上皮標志E-鈣黏蛋白及間葉標志纖維連接蛋白表達進行檢測,結(jié)果表明,予以SSD干預(yù)后,無論是復(fù)制肺纖維化模型的中期還是后期,E-鈣黏蛋白的表達下調(diào)均受到保護,而纖維連接蛋白的表達上調(diào)卻被抑制,這與德國COSTABEL等[9]提出的IPF的EMT學說結(jié)果一致,WOLTERS等[10-11]的研究也證實了這一結(jié)果。有研究[12-14]顯示,BLM組小鼠肺組織表達Wnt蛋白及β-catenin蛋白有明顯上調(diào),這可能與IPF患者的肺組織內(nèi)Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)通路異常激活,β-catenin是Wnt/β-Catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的核心因子有關(guān)[15]。SSD組中小鼠肺組織表達Wnt蛋白及β-catenin蛋白顯著低于BLM組,這可能是由于SSD通過抑制Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)通路介入EMT病理過程從而減緩肺組織纖維化進展。
依據(jù)IPF發(fā)病機制觀點的改變,治療IPF理念也發(fā)生相應(yīng)變化,目前推薦及早的給予抗纖維化,加上小劑量抗炎,在于預(yù)防而不是逆轉(zhuǎn)已存在的肺纖維化。2012年,Panther-IPF臨床實驗證實波尼松、硫唑嘌呤、N-乙酰半胱氨酸聯(lián)合治療IPF未有療效,反而增加病死率和住院風險[16]。因此,在IPF治療中,干預(yù)Wnt/β-catenin通路中的一個或幾個環(huán)節(jié),阻斷信號傳導(dǎo)鏈、抑制EMT進程,可以達到預(yù)防和控制病情的療效。