楊 洋，陶 濤，付 潔，何曉英，李小剛

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川瀘州 646000)

缺血性卒中是成人致殘最主要的原因，大多數(shù)腦梗死患者殘留嚴(yán)重而持久的神經(jīng)功能缺損。腦梗死后神經(jīng)再生和神經(jīng)可塑性是當(dāng)今神經(jīng)科學(xué)研究的熱點(diǎn)。目前認(rèn)為受損神經(jīng)元的軸突再生和突觸形成與神經(jīng)功能恢復(fù)密切相關(guān)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后神經(jīng)元信息網(wǎng)絡(luò)整合功能的重建，形成新的神經(jīng)環(huán)路，可促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。米諾環(huán)素是一種第二代半合成的四環(huán)素類抗生素，被認(rèn)為是目前最有前途的神經(jīng)保護(hù)劑。動(dòng)物研究表明，米諾環(huán)素可促進(jìn)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)元軸突再生[1]，近期一項(xiàng)臨床研究顯示，急性缺血性卒中患者早期使用米諾環(huán)素可促進(jìn)患者神經(jīng)功能的恢復(fù)[2]。本課題組前期的體外研究表明，米諾環(huán)素對(duì)PC12細(xì)胞氧糖剝奪損傷具有保護(hù)作用，可以顯著提高細(xì)胞的存活率且促進(jìn)神經(jīng)突的生長(zhǎng)[3]，但其具體機(jī)制尚不明確。肌球蛋白輕鏈磷酸酶(myosin light chain phosphatase,MLCP)是Rho激酶(ROCK)的下游底物之一，活化的ROCK滅活MLCP，使其不能水解MLC的磷酸基團(tuán)，從而提高細(xì)胞內(nèi)MLC的磷酸化水平，導(dǎo)致生長(zhǎng)錐的崩解及軸突回縮[4]。所以本研究旨在觀察米諾環(huán)素對(duì)氧糖剝奪/復(fù)氧后PC12細(xì)胞神經(jīng)突生長(zhǎng)的影響，并探討MLCP/MLC信號(hào)通路對(duì)神經(jīng)突生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 PC12細(xì)胞高分化細(xì)胞株(中科院上海細(xì)胞庫)，DMEM無糖培養(yǎng)基(Gibco公司)，鹽酸米諾環(huán)素(美國(guó)Sigma公司)，MLCP抑制劑Calyculin A、兔抗MLC和兔抗p-MLC(美國(guó)CST公司)，兔抗MAP-2及小鼠抗GAPDH(美國(guó)Santa Cruz公司)，Dylight標(biāo)記山羊抗兔抗體(碧云天生物公司)。其他試劑均購(gòu)于相應(yīng)代理商。

1.2PC12細(xì)胞的傳代培養(yǎng) 體外培養(yǎng)PC12細(xì)胞，每3天換液1次，待細(xì)胞長(zhǎng)滿80%～90%時(shí)，用0.25%胰酶消化后，以1∶3進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取第7～9代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)液吹打成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后分別以5×104/孔的細(xì)胞密度接種在96孔板，4×105/孔接種在24孔板，2×106/孔接種在75 cm2的培養(yǎng)瓶，置于37 ℃ 5% CO2恒溫孵箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3氧糖剝奪/復(fù)氧模型的建立 參照本課題組前期報(bào)道的方法[5]，先去掉培養(yǎng)液，PBS清洗3次后，加入不含血清的DMEM無糖培養(yǎng)基，置于含94% N2，1% O2和5% CO2的孵箱中培養(yǎng)，6 h后更換成DMEM高糖培養(yǎng)基，置于含5% CO2的正常氧孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.4實(shí)驗(yàn)分組 將PC12細(xì)胞隨機(jī)分為正常組、模型組、米諾環(huán)素組(MC組)和MLCP抑制劑組(Cal組)。正常組不進(jìn)行任何處理；模型組采取氧糖剝奪6 h再?gòu)?fù)氧24 h；米諾環(huán)素組在氧糖剝奪及復(fù)氧全過程中加入1 μmol/L米諾環(huán)素；MLCP抑制劑組在氧糖剝奪1 h前預(yù)先加入1 nmol/L MLCP抑制劑，余同米諾環(huán)素組。

1.5CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性 參照CCK-8試劑盒說明書，復(fù)氧24 h后，每組每孔均加入10 μL的CCK-8試劑，放入37 ℃孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，選擇490 nm波長(zhǎng)，然后在酶標(biāo)儀上檢測(cè)96孔板中各孔的吸光度值[OD490]，每組6個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，按公式計(jì)算PC12細(xì)胞的存活率=[實(shí)驗(yàn)組平均OD490/正常組平均OD490]×100%。

1.6免疫細(xì)胞熒光 復(fù)氧24 h后，從24孔板中取出長(zhǎng)有細(xì)胞的蓋玻片，PBS洗滌3次后，室溫下用4%多聚甲醛固定20 min，PBS漂洗3次后滴加0.3% Triton X-100 37 ℃下破膜20 min，PBS漂洗后加10%山羊血清置于37 ℃恒溫箱封閉45 min，去除血清后加入兔抗MAP2抗體(1∶100)于4 ℃恒溫箱孵育過夜，對(duì)照組用PBS代替一抗，PBS漂洗后加入Dylight 594標(biāo)記山羊抗兔抗體(1∶150)37 ℃避光孵育1 h，PBS漂洗后加入4′6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)核染5 min，50%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照，在200倍熒光顯微鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用Image-Proplus軟件對(duì)熒光圖像進(jìn)行分析，計(jì)算PC12細(xì)胞神經(jīng)突的平均長(zhǎng)度。

1.7Western blot 參照凱基全蛋白提取試劑盒說明書提取蛋白并測(cè)定樣品蛋白濃度，以1∶4加入5×上樣緩沖液，煮沸變性5 min。每孔加入100 μg蛋白樣品進(jìn)行電泳分離(12% SDS-PAGE，60 V、45 min，80 V、90 min)后轉(zhuǎn)膜(PDVF膜，250 mA、40 min)，分別加入一抗MLC(1∶1 000)，p-MLC(1∶500)和GAPDH(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，次日加入二抗(1∶3 000)孵育后ECL顯影并拍照，用Quantity One軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析，以目的與內(nèi)參條帶光密度的比值作為蛋白表達(dá)的相對(duì)含量。

2 結(jié) 果

2.1米諾環(huán)素對(duì)OGD/R損傷的PC12細(xì)胞的保護(hù)作用 復(fù)氧24 h后，模型組PC12細(xì)胞的存活率為(48.6±3.2)%，米諾環(huán)素(1 μmol/L)處理后能夠明顯提高氧糖剝奪/復(fù)氧后PC12細(xì)胞的存活率[(77.7±3.3)%,P<0.05,圖1]，而米諾環(huán)素對(duì)正常培養(yǎng)PC12細(xì)胞的存活率無影響(P>0.05)。

2.2米諾環(huán)素對(duì)GAP-43蛋白表達(dá)的影響 在正常組PC12細(xì)胞中加入米諾環(huán)素后GAP-43蛋白無明顯改變，米諾環(huán)素并不會(huì)促進(jìn)正常PC12細(xì)胞GAP-43的表達(dá)，也對(duì)正常PC12細(xì)胞無毒性作用；MC組GAP-43蛋白的表達(dá)(1.69±0.22)較模型組明顯升高(P<0.05)；而Gal組GAP-43蛋白的表達(dá)明顯低于MC組(0.32±0.13vs.1.69±0.22，P<0.05)，見圖2。

#：P<0.05，與正常組比較;★：P<0.05，與模型組比較

圖1米諾環(huán)素對(duì)PC12細(xì)胞氧糖剝奪/復(fù)氧損傷后的保護(hù)作用

1:正常組;2:模型組;3:MC組;4:Cal組;5:正常+MC組

圖2米諾環(huán)素對(duì)氧糖剝奪/復(fù)氧損傷后PC12細(xì)胞GAP-43蛋白表達(dá)的影響

2.3米諾環(huán)素促進(jìn)PC12細(xì)胞氧糖剝奪/復(fù)氧損傷后神經(jīng)突生長(zhǎng) 熒光顯微鏡下觀察可見正常組PC12細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞兩極各有一個(gè)長(zhǎng)突起(圖3)。模型組神經(jīng)突平均長(zhǎng)度為(15.75±5.92)μm，MC組為(44.79±5.36)μm，Cal組為(25.33±5.39)μm，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A:正常組；B:模型組；C:MC組；D:Cal組

圖3米諾環(huán)素對(duì)氧糖剝奪/復(fù)氧損傷后PC12細(xì)胞神經(jīng)突生長(zhǎng)的影響(×200)

2.4米諾環(huán)素對(duì)PC12細(xì)胞OGD/R損傷后MLC磷酸化的影響 正常組PC12細(xì)胞中p-MLC蛋白僅有少量表達(dá)(0.21±0.06)；模型組p-MLC的表達(dá)顯著增加(1.02±0.12)，經(jīng)米諾環(huán)素處理后，PC12細(xì)胞p-MLC的表達(dá)較模型組明顯下降(0.33±0.07)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；預(yù)先加入抑制劑Calyculin A的PC12細(xì)胞， p-MLC的表達(dá)較MC組明顯增加(1.38±0.09，P<0.05)。各組間MLC蛋白的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖4。

1：正常組；2：模型組；3：MC組；4：Cal組

圖4米諾環(huán)素對(duì)氧糖剝奪/復(fù)氧損傷后PC12細(xì)胞MLC磷酸化的影響

3 討 論

缺血缺氧性腦損傷可造成不同程度的神經(jīng)功能缺損，而神經(jīng)功能的恢復(fù)與神經(jīng)元的修復(fù)及軸突再生密切相關(guān)，促進(jìn)軸突再生、神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)重建以及突觸環(huán)路的形成是目前研究的熱點(diǎn)，也成為神經(jīng)康復(fù)的首要目標(biāo)。PC12細(xì)胞氧糖剝奪/復(fù)氧損傷真實(shí)地反映了缺血性腦卒中引起的腦損害。

米諾環(huán)素是一種高脂溶性的四環(huán)素類抗生素，它具有抗菌和抗炎活性并被臨床實(shí)踐證實(shí)為一種治療粉刺和關(guān)節(jié)炎的有效藥物。米諾環(huán)素能有效的通過血腦屏障從而在顱腦創(chuàng)傷、卒中、脊髓損傷、神經(jīng)退行性疾病如肌萎縮性側(cè)索硬化、帕金森病、亨廷頓病及多發(fā)性硬化等疾病的動(dòng)物模型中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[6-7]。近年來多項(xiàng)體外研究表明米諾環(huán)素對(duì)PC12細(xì)胞氧糖剝奪/復(fù)氧損傷具有一定的保護(hù)作用[8-9]，本研究前期的研究結(jié)果顯示，100 nmol/L至10 μmol/L米諾環(huán)素能提高氧糖剝奪/復(fù)氧損傷后PC12細(xì)胞的存活率，其中1 μmol/L米諾環(huán)素對(duì)PC12細(xì)胞的保護(hù)作用最佳。因此本試驗(yàn)選取該濃度的米諾環(huán)素用于后續(xù)神經(jīng)突生長(zhǎng)的研究。

RhoA/ROCK信號(hào)途徑是調(diào)節(jié)神經(jīng)元軸突再生的主要信號(hào)通路，其下游底物之一肌球蛋白輕鏈(myosin light chain,MLC)是重要的細(xì)胞骨架蛋白之一，相對(duì)分子質(zhì)量為20×103，其表達(dá)與突觸再生密切相關(guān)。細(xì)胞內(nèi)的MLC磷酸化水平對(duì)調(diào)節(jié)突出再生起到重要作用，在肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)和肌球蛋白輕鏈磷酸酶(MLCP)雙重調(diào)節(jié)下，MLC發(fā)生磷酸化和去磷酸化的相互轉(zhuǎn)化。既往研究證實(shí)，Calyculin A可通過抑制MLCP阻斷神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)對(duì)PC12細(xì)胞神經(jīng)突生長(zhǎng)的促進(jìn)作用[10]。生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43(GAP-43)是一種表達(dá)在軸突末梢的突出前蛋白，與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、突觸形成和神經(jīng)再生有著密切關(guān)系，已經(jīng)被證實(shí)在神經(jīng)細(xì)胞受損之后的軸突再生過程中表達(dá)明顯增高，且在促進(jìn)神經(jīng)突生長(zhǎng)和突出重塑中起到至關(guān)重要的作用[11-12]，可通過觀察其表達(dá)水平，了解軸突再生情況。

本研究發(fā)現(xiàn)，氧糖剝奪/復(fù)氧可誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡，降低其存活率，并通過上調(diào)p-MLC，誘導(dǎo)神經(jīng)突回縮或抑制軸突再生。復(fù)氧24 h后，MC組較模型組PC12細(xì)胞存活率明顯增高，說明米諾環(huán)素可緩解PC12細(xì)胞氧糖剝奪/復(fù)氧損傷。模型組較正常組p-MLC水平明顯增高，而MC組較模型組p-MLC有明顯下降趨勢(shì)，且細(xì)胞存活率、GAP-43的表達(dá)及軸突長(zhǎng)度測(cè)定較模型組均有明顯增高，說明米諾環(huán)素可能通過調(diào)節(jié)MLCP/MLC信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)MLC的磷酸化水平，進(jìn)而緩解氧糖剝奪/復(fù)氧對(duì)PC12細(xì)胞的損傷作用并促進(jìn)軸突再生。模型組較MC組p-MLC表達(dá)明顯增高，GAP-43表達(dá)明顯減少，且神經(jīng)突長(zhǎng)度明顯縮短，說明Calyculin A可能阻斷了米諾環(huán)素與MLCP/MLC信號(hào)通路的相互作用。因此，筆者認(rèn)為MLCP/MLC信號(hào)通路可能與米諾環(huán)素促進(jìn)PC12細(xì)胞氧糖剝奪/復(fù)氧損傷后神經(jīng)軸突再生密切相關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)1 μmol/L米諾環(huán)素對(duì)PC12細(xì)胞氧糖剝奪/復(fù)氧損傷具有保護(hù)作用，可明顯提高損傷細(xì)胞的存活率，顯著促進(jìn)缺血缺氧/復(fù)氧之后神經(jīng)突的生長(zhǎng)，其機(jī)制可能為米諾環(huán)素促進(jìn)受損的PC12細(xì)胞中MLCP/MLC信號(hào)通路激活，使得 MLC磷酸化水平降低，同時(shí)促進(jìn)GAP-43表達(dá)增加，進(jìn)而促進(jìn)軸突再生及突觸網(wǎng)絡(luò)的重建。本研究發(fā)現(xiàn)，米諾環(huán)素對(duì)氧糖剝奪/復(fù)氧損傷的PC12細(xì)胞神經(jīng)突生長(zhǎng)的促進(jìn)作用與MLCP/MLC信號(hào)通路的激活密切相關(guān)，揭示了米諾環(huán)素促進(jìn)PC12細(xì)胞神經(jīng)突生長(zhǎng)潛在的細(xì)胞和分子機(jī)制，為將來的臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。未來的研究可進(jìn)一步探索MLCP/MLC信號(hào)通路激活靶點(diǎn)，為新型藥物的研究提供理論依據(jù)。