王曉華，張玉娟

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦科，河北承德 067000)

子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率逐年上升，早期患者經(jīng)外科手術(shù)治療預(yù)后較好，但晚期患者的中位生存時(shí)間不超過1年[1]，侵襲轉(zhuǎn)移是影響晚期腫瘤患者生存率的重要因素。Livin基因是凋亡蛋白抑制因子(IAPs)家族中的一員，目前對(duì)Livin的研究主要集中在其抗細(xì)胞凋亡方面，而對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響目前鮮有報(bào)道。本研究應(yīng)用RNA干擾技術(shù)特異性下調(diào)Livin基因表達(dá)水平，觀察Livin對(duì)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株(HEC-1-A)細(xì)胞侵襲及遷移能力的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 HEC-1-A細(xì)胞株購(gòu)自廣州吉妮歐公司。

1.1.2小分子干擾RNA 特異性小分子干擾RNA(Livin-siRNA)和陰性對(duì)照序列(Livin-NC)由蘇州吉瑪公司設(shè)計(jì)合成。

1.1.3主要試劑 Lipofectamine 2000、SYBR Green qPCR SuperMIX-UDG購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Trizol 購(gòu)自美國(guó)Ambion公司；Takara RNA PCR TM KIT(AMV)Ver.3.0購(gòu)自日本TaKaRa公司；Livin、β-actin兔多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司；Matrigel matrix Basement membrane購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染 在轉(zhuǎn)染前24 h將細(xì)胞以1×105/mL密度接種在6孔板中，使轉(zhuǎn)染期間細(xì)胞豐度為30%～50%。根據(jù)Lipofectamine 2000說(shuō)明進(jìn)行轉(zhuǎn)染試劑的制備。試驗(yàn)分為L(zhǎng)ivin-si組(轉(zhuǎn)染Livin-siRNA干擾序列)、Livin-NC組(轉(zhuǎn)染Livin-NC陰性對(duì)照序列)和Livin-B組(正常培養(yǎng)的HEC-1-A細(xì)胞)。轉(zhuǎn)染6 h后棄去原培養(yǎng)基，更換為含10%胎牛血清(FBS)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2qRT-PCR檢測(cè)Livin mRNA表達(dá) 轉(zhuǎn)染后48 h，用預(yù)冷卻的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌6孔板中的細(xì)胞2次，Trizol法提取細(xì)胞總RNA。由大連寶生物公司設(shè)計(jì)合成目的基因Livin及內(nèi)參基因GAPDH的引物序列(表1)。根據(jù)Takara RNA PCR TM KIT(AMV)Ver.3.0說(shuō)明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1條鏈，應(yīng)用SYBR Green qPCR SuperMIX-UDG 試劑盒進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min共1循環(huán)，95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s共40循環(huán)，然后95 ℃ 1 min、60 ℃ 30 s、95 ℃ 30 s進(jìn)行熔解曲線分析。應(yīng)用2-△△ct方法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 Livin和GAPDH引物序列

1.2.3Western blot檢測(cè)Livin蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)染后48 h收集各組細(xì)胞，將蛋白裂解液加入細(xì)胞沉淀中并在冰浴中孵育30 min。BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白含量后，取50 μg進(jìn)行凝膠電泳，分離蛋白并電轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，二抗(1∶3 000)孵育1 h。電化學(xué)發(fā)光(ECL)超敏化學(xué)發(fā)光液顯影，Tanon 6100化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行成像分析，目的蛋白Livin與內(nèi)參蛋白β-actin的光密度比值計(jì)算Livin的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4Transwell小室侵襲及遷移試驗(yàn) 使用Coring的小室模型，Matrigel基質(zhì)膠1∶5稀釋后每個(gè)小室100 μL均勻包被小室基底膜。收集轉(zhuǎn)染48 h后各組細(xì)胞，加入DMEM培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至4×105/mL，上室加入100 μL細(xì)胞懸液，下室加入600 μL 含20%FBS培養(yǎng)基。培養(yǎng)36 h甲醇固定，結(jié)晶紫染色，樹膠封片。顯微鏡下觀察6個(gè)視野細(xì)胞數(shù)量計(jì)數(shù)取平均值，每組3個(gè)小室。遷移試驗(yàn)不用包被Matrigel基質(zhì)膠，培養(yǎng)箱孵育時(shí)間為26 h，其余同細(xì)胞侵襲試驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后Livin mRNA表達(dá)情況 Livin-si組與Livin-NC組、Livin-B組比較，Livin mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=95.976,P=0.007)；Livin-NC組與Livin-B組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。

圖1 轉(zhuǎn)染后3組細(xì)胞Livin mRNA比較

2.2Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后Livin蛋白表達(dá)情況 Livin-si組比較Livin-NC組、Livin-B組，Livin蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯較少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=603.705,P=0.002)；Livin-NC組與Livin-B組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2、3。

A：Livin-si組；B：Livin-NC組；C：Livin-B組

圖2 3組細(xì)胞Western blot蛋白條帶

圖3 轉(zhuǎn)染后3組細(xì)胞Livin蛋白表達(dá)比較

2.3干擾Livin表達(dá)后細(xì)胞侵襲及遷移能力變化 Transwell小室侵襲試驗(yàn)中，Livin-si組與Livin-NC組、Livin-B組比較，穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=41.026,P=0.001)。遷移試驗(yàn)中，與Livin-NC組和Livin-B組相比，Livin-si組穿膜細(xì)胞數(shù)同樣明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=42.058,P<0.01)，見圖4～6。

A:Livin-si組；B：Livin-NC組

圖4干擾Livin表達(dá)后細(xì)胞侵襲能力變化(結(jié)晶紫染色，×200)

A:Livin-si組；B：Livin-NC組

圖5干擾Livin表達(dá)后細(xì)胞遷移能力變化(結(jié)晶紫染色，×200)

圖6 干擾Livin表達(dá)后3組穿膜細(xì)胞數(shù)比較

3 討 論

子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率逐年上升且呈低齡化趨勢(shì)發(fā)展，尤其是Ⅱ型內(nèi)膜癌因其更具有早期侵襲轉(zhuǎn)移的傾向，臨床預(yù)后更差，控制其浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移則成為臨床治療中亟待解決的問題[2-3]。目前對(duì)于惡性腫瘤的治療方法，除了手術(shù)和放化療外，基因靶向治療為惡性腫瘤的治療提供了新的方向[4]。基因靶向治療的策略是通過制備正?；虼娲嬖谶z傳缺陷的基因，或關(guān)閉、抑制異?；虻谋磉_(dá)。

Livin是IAPs家族的成員，編碼Livin的桿狀病毒IAP重復(fù)序列7(BIRC7)基因位于人類染色體20q13.3上，長(zhǎng)度為46 kb，包含7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子。 研究表明Livin在淋巴瘤、白血病、黑色素瘤、乳腺癌、胃腸腫瘤、肝癌、肺癌、宮頸癌等一些腫瘤組織中特異性高表達(dá)[5-11]。孫炯等[12-14]研究發(fā)現(xiàn)Livin在子宮內(nèi)膜癌中存在異常高表達(dá)，并且與子宮內(nèi)膜癌的分期、病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。大量的研究報(bào)道主要是針對(duì)Livin基因促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、抑制其凋亡的作用。然而，最近的研究表明Livin不僅參與了腫瘤細(xì)胞的抗凋亡機(jī)制，同時(shí)還在腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮作用[15-16]。LIU等[17]研究表明，Livin可以促進(jìn)肝癌 HepG2細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力。ZHAO等[18]研究發(fā)現(xiàn)，Livin在胃癌BGC832 細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用，干擾Livin表達(dá)可明顯抑制BGC832 細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。

本課題選擇生物學(xué)行為更具侵襲性的HEC-1-A細(xì)胞(中低分化腺癌)作為研究對(duì)象，構(gòu)建Livin的小分子干擾RNA，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，qRT-PCR和Western blot分析評(píng)估Livin mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。研究結(jié)果表明，用Livin-siRNA轉(zhuǎn)染的HEC-1-A細(xì)胞Livin表達(dá)水平下調(diào)，表明所選靶序列的有效性。抑制Livin表達(dá)后，HEC-1-A細(xì)胞的侵襲和遷移能力明顯減弱。CHEN等[19]研究顯示，在前列腺癌PC-3、DU-145細(xì)胞系中，Livin是通過NF-κB信號(hào)通路調(diào)節(jié)大分子糖蛋白FN，進(jìn)而調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞的侵襲能力。但Livin調(diào)節(jié)HEC-1-A細(xì)胞侵襲及遷移能力的具體分子機(jī)制目前尚不明確，是否也通過上述信號(hào)通路調(diào)節(jié)尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，Livin在子宮內(nèi)膜癌的侵襲及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了一定的作用，干擾Livin表達(dá)可以為子宮內(nèi)膜癌的靶向治療提供一定的理論依據(jù)。