付 媛，楊浩池，陸 睿，陳明會(huì)，李劍星，呂 婕，劉亦恒，張海英△

(1.廣東醫(yī)科大學(xué)人體解剖學(xué)教研室，廣東東莞 523808;2.海南醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，?？?571101; 3.海南省海口市人民醫(yī)院骨科中心 570208)

小膠質(zhì)細(xì)胞是位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的固有的巨噬細(xì)胞樣免疫效應(yīng)細(xì)胞，同時(shí)也是腦內(nèi)神經(jīng)炎癥調(diào)節(jié)過程中的主要效應(yīng)細(xì)胞[1-2]。但當(dāng)小膠質(zhì)細(xì)胞被異常激活，長(zhǎng)期處于過度活化狀態(tài)時(shí)，可以產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì)和炎癥因子，引起慢性炎性反應(yīng)，損傷神經(jīng)元，使神經(jīng)元退化、變性甚至死亡[3]。漆樹科植物漆樹(rhus verniciflua stokes)皮中含有豐富的黃酮類物質(zhì)，其活性成分有紫鉚因。研究發(fā)現(xiàn)，紫鉚因具有抗氧化、抗炎癥、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等多種藥理作用[4]。因此，本研究擬用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)作為誘導(dǎo)激活劑，用 BV2細(xì)胞系作為小膠質(zhì)細(xì)胞的體外模型細(xì)胞，建立體外神經(jīng)炎癥模型，探討紫鉚因?qū)PS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化引起炎性反應(yīng)的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 BV2小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明細(xì)胞庫(kù)；紫鉚因、脂多糖、MTT購(gòu)自Sigma公司； TRIzol Reagent 購(gòu)自Life Invitrogen 公司； Taq SYBR Green qPCR Premix購(gòu)自Nova公司； HRP山羊抗小鼠IgG、HRP驢抗兔IgG購(gòu)自Thermo公司；Cy3 山羊抗兔IgG購(gòu)自Millipore公司；β-actin小鼠單克隆抗體購(gòu)自Sigma公司；p44/42 MAPK(ERK1/2)兔單克隆抗體、Phospho-p44/42 MAPK(ERK1/2)兔單克隆抗體、MEK1/2兔單克隆抗體、Phospho-MEK1/2兔單克隆抗體、Phospho-c-Raf兔單克隆抗體、NF-κB p65兔單克隆抗體購(gòu)自Cell Signalling公司；Raf-1兔單克隆抗體購(gòu)于Abcam公司；Lamin B 兔多克隆抗體購(gòu)于Santa Cruz公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) BV2小膠質(zhì)細(xì)胞使用含10%胎牛血清和1%的青鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)基，培養(yǎng)于25 cm2的細(xì)胞瓶中，置37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為正常組：BV2細(xì)胞正常培養(yǎng)，不添加任何干預(yù)因素；模型組：LPS(10 μg/mL)誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞活化；實(shí)驗(yàn)組：紫鉚因(1、10、30 μg/mL)預(yù)處理2 h后，與LPS(10 μg/mL)共培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2MTT法檢測(cè)紫鉚因?qū)π∧z質(zhì)細(xì)胞存活率的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的正常BV2細(xì)胞，以1×105個(gè)/mL密度接種于96孔板，培養(yǎng)過夜后換無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行加藥處理，加入不同濃度紫鉚因(0、1、10、30、50、100 μg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，24 h后進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)細(xì)胞存活率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3qPCR法檢測(cè)炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA的表達(dá)變化 根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組收集細(xì)胞按TRIzol說明書提取RNA，檢測(cè)所提RNA純度及完整性，根據(jù)HiFi-MMLV cDNA Kit說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，根據(jù)Taq SYBR Green qPCR Premix進(jìn)行qPCR反應(yīng)，觀察炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA的表達(dá)，引物于NCBI網(wǎng)站設(shè)計(jì)，并經(jīng)過比對(duì)，由上海生工公司合成，具體序列見表1；反應(yīng)參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性10 s，60 ℃退火15s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)，以GAPDH為內(nèi)參擴(kuò)增目的基因，用2-△△Ct方法進(jìn)行相對(duì)定量分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4Western blot檢測(cè)NF-κB p65、ERK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組收集細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞核蛋白和漿蛋白提取試劑盒提取核蛋白和胞漿蛋白，用RAPI裂解液提取總蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度后，取30 μL上樣經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移到NC膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，β-actin(1∶5 000)，p-ERK(1∶2 000)、ERK、MEK、p-MEK、Raf、p-Raf、NF-κB p65均(1∶1 000)4 ℃搖床低速孵育過夜；加入 HRP標(biāo)記的二抗(1∶5 000)室溫輕搖孵育1 h，于凝膠成像儀中顯影拍照，以β-actin作為內(nèi)參確定組間目標(biāo)蛋白表達(dá)的差異和變化,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 qPCR引物序列

1.2.5免疫熒光法檢測(cè)紫鉚因?qū)?NF-κB p65核轉(zhuǎn)移的影響 將各組細(xì)胞接種于小圓片上， 處理結(jié)束后4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞20 min；5%驢血清+0.1% Triton封閉、打孔、通透90 min； NF-κB p65(1∶400)4 ℃搖床低速孵育過夜；加入cy3山羊抗兔熒光二抗(1∶200)，37 ℃孵育1 h；加入DAPI復(fù)染細(xì)胞核5 min；取出小圓片，事先于載玻片上滴加抗熒光淬滅劑，于正置熒光顯微鏡下觀察、成像,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1LPS誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞活化細(xì)胞模型建立 參照文獻(xiàn)[5-6]中采用的LPS劑量，本實(shí)驗(yàn)中選用LPS濃度為10 μg/mL干預(yù)正常BV2小膠質(zhì)細(xì)胞，并且預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示用LPS 10 μg/mL干預(yù)正常BV2細(xì)胞24 h后，對(duì)細(xì)胞存活率無(wú)明顯影響。

2.2MTT法檢測(cè)紫鉚因?qū)V2小膠質(zhì)細(xì)胞存活率的影響 與正常組相比，各濃度的紫鉚因?qū)V2細(xì)胞存活率均無(wú)明顯影響，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。

圖1 紫鉚因?qū)V2細(xì)胞存活率的影響(n=3)

2.3qPCR檢測(cè)紫鉚因?qū)PS誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞活化后炎癥因子mRNA表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組細(xì)胞炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)；而實(shí)驗(yàn)組添加紫鉚因預(yù)處理后，IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA的表達(dá)顯著下調(diào)，并呈濃度依賴性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

2.4免疫熒光觀察紫鉚因?qū)PS誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞活化后NF-κB p65核轉(zhuǎn)移的影響 正常組細(xì)胞中NF-κB p65主要在胞質(zhì)表達(dá)，核內(nèi)幾乎看不到其熒光表達(dá)；模型組細(xì)胞中NF-κB p65被激活，NF-κB p65從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至核內(nèi)；而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞結(jié)果顯示，紫鉚因能明顯抑制NF-κB p65的激活并下調(diào)其轉(zhuǎn)錄活性，阻止NF-κB p65向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，見圖3。

#：P<0.05，與正常組比較；*：P<0.05，與模型組比較

圖2紫鉚因?qū)PS誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞活化后炎癥因子mRNA表達(dá)的影響(n=3)

2.5Western blot檢測(cè)紫鉚因?qū)PS誘導(dǎo) BV2小膠質(zhì)細(xì)胞活化后NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示，正常組細(xì)胞中NF-κB p65蛋白主要在胞質(zhì)中表達(dá)，細(xì)胞核內(nèi)不表達(dá)或表達(dá)量很低；模型組細(xì)胞內(nèi)NF-κB p65蛋白發(fā)生明顯的核轉(zhuǎn)移，由胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至核內(nèi)，表現(xiàn)為胞質(zhì)內(nèi)NF-κB p65蛋白表達(dá)明顯降低，核內(nèi)NF-κB p65蛋白表達(dá)明顯升高；而實(shí)驗(yàn)組添加紫鉚因預(yù)處理后，NF-κB p65在核內(nèi)表達(dá)降低，胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)升高，并呈一定的濃度依賴性，見圖4。

圖4 紫鉚因?qū)PS誘導(dǎo) BV2小膠質(zhì)細(xì)胞活化后NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響(n=3)

2.6Western blot檢測(cè)紫鉚因?qū)PS誘導(dǎo) BV2小膠質(zhì)細(xì)胞活化后ERK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組細(xì)胞在LPS誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞活化后，細(xì)胞內(nèi)ERK信號(hào)通路蛋白的磷酸化水平明顯上調(diào)，p-MEK、p-ERK蛋白表達(dá)水平顯著升高，但是p-Raf表達(dá)無(wú)明顯變化。實(shí)驗(yàn)組添加紫鉚因預(yù)處理后，能明顯抑制細(xì)胞內(nèi)p-MEK、p-ERK蛋白表達(dá)增強(qiáng)，對(duì)p-Raf表達(dá)依然無(wú)明顯作用，Raf、MEK、ERK的表達(dá)均無(wú)變化，見圖5。

圖5 紫鉚因?qū)PS誘導(dǎo) BV2小膠質(zhì)細(xì)胞活化后ERK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(n=3)

3 討 論

小膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)主要的免疫效應(yīng)細(xì)胞，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的改變非常敏感，很容易受外界刺激而激活，小膠質(zhì)細(xì)胞一旦被激活，誘發(fā)一系列的慢性炎性反應(yīng)，釋放大量炎癥介質(zhì)、促炎因子和神經(jīng)毒素，產(chǎn)生過量的氧自由基和亞硝基復(fù)合物，長(zhǎng)期炎性刺激，導(dǎo)致神經(jīng)元的突觸功能障礙，促使神經(jīng)元死亡，加速神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展[7-8]。因此，針對(duì)存在慢性神經(jīng)炎癥損傷的中樞神經(jīng)退行性疾病的治療中，比如是阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的異常激活或許具有潛在的臨床應(yīng)用前景。紫鉚因是一種黃酮類化合物，是漆樹科植物漆樹皮的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎癥、抗癌等多種生物活性[4]。近來的研究表明，紫鉚因?qū)劝彼嵴T導(dǎo)的神經(jīng)毒性具有抑制作用，可以降低氧化應(yīng)激及減少氧自由基的產(chǎn)生[9]；有研究證實(shí)，紫鉚因?qū)Υ笫蠹毙约顾钃p傷模型具有保護(hù)作用，但其抗炎作用機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)中MTT結(jié)果顯示，紫鉚因本身對(duì)細(xì)胞活力無(wú)明顯影響，說明紫鉚因?qū)π∧z質(zhì)細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性。在LPS激活小膠質(zhì)細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表達(dá)明顯升高，而紫鉚因干預(yù)后，可以顯著降低以上炎癥因子的表達(dá)，說明紫鉚因可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，減少炎癥因子的產(chǎn)生。進(jìn)而，對(duì)紫鉚因抑制小膠質(zhì)活化的可能作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS活化小膠質(zhì)細(xì)胞后，NF-κB p65被激活，從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至核內(nèi)，并且ERK信號(hào)通路相關(guān)蛋白p-MEK、p-ERK水平升高。紫鉚因干預(yù)后，明顯逆轉(zhuǎn)NF-κB p65的核轉(zhuǎn)移，下調(diào)p-MEK、p-ERK的表達(dá)，進(jìn)而減輕炎性反應(yīng)。由此推斷，紫鉚因的抗炎作用可能與ERK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的調(diào)控有關(guān)。

神經(jīng)炎癥的病理過程與炎癥因子和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生密切相關(guān)，NF-κB(核轉(zhuǎn)錄因子κB)和MAPK家族(包括JNK，p38和ERK)在其中起到了關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[10]。NF-κB是一種在細(xì)胞及組織內(nèi)廣泛存的轉(zhuǎn)錄因子，是多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的交叉點(diǎn)，并且是細(xì)胞凋亡、增殖及分化的關(guān)鍵位點(diǎn)，參與多種相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[11]。NF-κB廣泛存在于膠質(zhì)細(xì)胞系，屬于NF-κB/Rel蛋白家族中的一員，最常見形式是由多肽鏈P50和P65 2個(gè)亞基組成的異源二聚體。細(xì)胞處于靜息狀態(tài)時(shí)，NF-κB位于胞質(zhì)中，與抑制蛋白(IκB)單體結(jié)合組成復(fù)合物，呈非活性形式。當(dāng)細(xì)胞受到外界各種信號(hào)刺激時(shí)，NF-κB被激活，從復(fù)合物結(jié)構(gòu)中游離出來，并移位至細(xì)胞核，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄[12-13]。炎癥基因的表達(dá)正是受NF-κB的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常組細(xì)胞中NF-κB p65主要在胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)；模型組由于炎癥因子的刺激，NF-κB p65被激活，由胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至核內(nèi)，而添加紫鉚因預(yù)處理抑制NF-κB p65的激活，降低它的轉(zhuǎn)錄活性，阻止其向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，進(jìn)而下調(diào)炎癥因子的表達(dá)，抑制炎性反應(yīng)，從而阻止炎性反應(yīng)對(duì)神經(jīng)元的損傷。MAPKs信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)最重要的信號(hào)通路之一，廣泛參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡等過程。ERK是其中一條途徑，Raf、MEK都是ERK的上游分子。正常情況下，細(xì)胞中的Raf/MEK/ERK均以非磷酸化的形式存在，呈無(wú)活性狀態(tài)；當(dāng)受外界刺激時(shí)，Raf/MEK/ERK蛋白發(fā)生磷酸化，呈功能活性狀態(tài)，啟動(dòng)相關(guān)細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的基因表達(dá)[15-16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組細(xì)胞中p-MEK、p-ERK蛋白表達(dá)均明顯升高，呈活性功能狀態(tài)，而添加紫鉚因預(yù)處理可以顯著逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象，并呈一定的濃度依賴性。說明紫鉚因抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化的作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)ERK 信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，紫鉚因可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，通過下調(diào)炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)從而減輕炎性反應(yīng)，其作用機(jī)制可能與紫鉚因下調(diào)NF-κB p65的轉(zhuǎn)錄活性和抑制ERK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過這一系列的離體實(shí)驗(yàn)為紫鉚因可能具有抑制慢性神經(jīng)炎癥發(fā)展的這一作用，提供了一定的理論依據(jù)，也為后續(xù)的在體試驗(yàn)打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。