吳增，董賢慧，李媛，靳曉飛，周曉紅，高維娟△

神經(jīng)干細胞（neural stem cells，NSCs）是神經(jīng)系統(tǒng)的始祖細胞，具有自我更新與分化的能力，通過對稱性分裂產(chǎn)生兩個完全相同的NSCs，通過非對稱性分裂分化為其他細胞（神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞）。NSCs作為一種特殊的干細胞，具有獨特的生物學特性（分化性、遷移性、趨化性和低免疫原性），因此NSCs移植在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病中具有良好前景。開展NSCs移植的前提是獲得活力和穩(wěn)定性均較高的種子細胞，而NSCs較其他細胞更加脆弱，對外界環(huán)境的變化非常敏感，所以提取NSCs的技術操作應十分精細，并全面把控體外培養(yǎng)NSCs的影響因素?；谥T多研究者的培養(yǎng)經(jīng)驗，本課題組經(jīng)過長期實踐，篩選并建立了一套完善、實用、可靠的NSCs提取及體外培養(yǎng)方法，現(xiàn)報告如下。

1 主要材料和儀器

1.1 實驗動物 健康清潔級SD孕鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號為SCXK（京）2016?0011。

1.2 主要試劑和儀器 主要試劑：DMEM/F?12（1∶1）、B?27、Accutase酶均購于Gibco公司；堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、表皮生長因子（EGF）均購于PeproTect公司；胎牛血清購于浙江天杭生物科技有限公司；胰蛋白酶購于北京索萊寶科技有限公司。主要儀器：3111型二氧化碳培養(yǎng)箱購于Thermo公司；SW?CJ?2FDSW?CJ?2FD潔凈工作臺購于蘇州安泰空氣技術有限公司；IX73型生物顯微鏡購于OLYMPUS公司；H2050R型離心機購于長沙湘儀離心機儀器有限公司。

2 神經(jīng)干細胞的提取

2.1 提取步驟 取孕14 d SD大鼠1只，麻醉后將其浸泡于75%乙醇中0.5 h（僅露出頭部），然后用無菌器械取出子宮，將子宮置于75%乙醇中浸泡2 min。在潔凈工作臺內(nèi)解剖子宮，將胎鼠置于預冷的D?Hank’s液中，迅速取出胎鼠雙側(cè)大腦皮質(zhì)，置于含有D?Hank’s液的培養(yǎng)皿中，迅速用鑷子仔細剝除腦膜，轉(zhuǎn)移至含有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，眼科剪剪碎，用無菌吸管轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以10～12次/min的頻率緩慢輕柔吹打含有腦組織的培養(yǎng)基（機械吹打法），吹打至無肉眼可見組織塊，以1 000 r/min離心5 min，去上清，加入NSCs無血清培養(yǎng)基，輕柔吹打成細胞懸液，先后過200目和500目細胞篩，細胞計數(shù)后以1×106個/mL密度接種，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，見圖1。

Fig.1 A good condition of the neurospheres(×400)圖1 狀態(tài)良好的神經(jīng)球（×400）

2.2 提取要點

2.2.1 鼠齡的選擇 大鼠的NSCs于胚胎第12天開始出現(xiàn)，第14～15天達到高峰[1?3]。

2.2.2 無菌操作 原代細胞提取過程中保持無菌原則至關重要，且NSCs較其他細胞更脆弱，因此更需注意無菌操作。主要環(huán)節(jié)：保持操作環(huán)境無菌，取材室和細胞室紫外線消毒20 min；操作人員嚴格消毒程序，換滅菌鞋、換無菌衣、戴口罩、戴帽子、洗手、穿無菌手術衣；通過乙醇浸泡和紫外線照射兩種方法對實驗動物進行徹底滅菌；對所有取材器械進行高壓滅菌。

2.2.3 低溫與營養(yǎng)支持 在提取過程中，應保持NSCs處于低溫環(huán)境并給予營養(yǎng)支持。低溫是活體組織和離體細胞長期保存的一種有效方法，主要通過降低細胞代謝率來起到保護作用。實驗操作全程在冰板上進行，D?Hank’s液預冷，使腦組織處于低溫環(huán)境中，可以最大限度提高細胞的存活率。為保證細胞的存活率，在D?Hank’s液中剝除腦膜后應立即將腦組織轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基中，接種前便給予營養(yǎng)支持。

2.2.4 細胞分離方法 原代細胞分離常采用機械吹打和胰酶消化兩種方法。機械吹打法即提取步驟中所提及的方法。胰酶消化法：用無菌吸管將剪碎的大腦皮質(zhì)轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，靜置2 min，去上清，加入1 mL 0.125%胰酶，消化10 min，加入培養(yǎng)基終止消化，以1 000 r/min離心5 min，去上清，加入培養(yǎng)基，輕柔吹打成細胞懸液，過細胞篩，細胞計數(shù)后接種。胰酶消化的時間很難控制，如果消化時間過長會導致消化后活細胞比例較低；胎鼠腦組織中細胞外基質(zhì)和結(jié)締組織均較少，細胞間連接不緊密，取得大腦皮質(zhì)后，用眼科剪剪碎，直接輕柔吹打即可，最后將細胞懸液用細胞篩過濾，可以得到高存活率的單細胞懸液。

2.2.5 細胞過篩 目的是最大限度將腦組織分離為單細胞，并去除未剝離干凈的腦膜。許多研究者在實驗中采用100目細胞篩（孔徑150 μm）[4]、200目細胞篩（孔徑75 μm）[5?6]、400目細胞篩（孔徑38 μm）[7]等不同孔徑的篩網(wǎng)。本課題組采用以上3個規(guī)格的細胞篩過濾后，在細胞培養(yǎng)過程中均發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中有少量腦膜存在。NSCs的形態(tài)近似于圓形，直徑在5～10 μm，因此課題組先后采用200目和500目細胞篩（孔徑30 μm）過濾，過濾后的細胞懸液鏡下觀察未發(fā)現(xiàn)殘存的腦膜，而且可以將絕大部分腦組織分離成單細胞。此外，少量腦膜的存在對于NSCs成球率和未分化狀態(tài)的穩(wěn)定性無影響。

3 培養(yǎng)基選擇的依據(jù)

血清含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，對促進細胞生長有積極作用。但有研究表明含血清培養(yǎng)基可以誘導NSCs分化，不利于維持NSCs處于未分化狀態(tài)[8]，因此課題組采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)NSCs。大部分研究者采用由DMEM/F12（98%）+B27（2%）+bFGF（20 μg/L）+EGF（20 μg/L）配置而成的培養(yǎng)基。DMEM/F12培養(yǎng)基是NSCs體外培養(yǎng)常用的基礎培養(yǎng)基[9]。有研究指出B27能促進原代NSCs的增殖[10]。值得注意的是，Gibco公司生產(chǎn)的B27有多種類型，其中不含維生素A的B27不會誘導NSCs向神經(jīng)元方向分化，有利于保持NSCs處于未分化狀態(tài)。bFGF可以促進NSCs的增殖[11]。EGF既可以促進NSCs的增殖，又可以促進其向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞分化。bFGF與EGF聯(lián)合應用可以促進NSCs體外增殖，抑制其分化[12]。本課題組采用由DMEM/F12（97%）+B27（2%）+青鏈霉素（1%）+bFGF（20 μg/L）+EGF（20 μg/L）配置而成的NSCs無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)出了狀態(tài)良好的神經(jīng)球。需要注意的是，為保持bFGF和EGF的最大活性，每次應少量配制培養(yǎng)基。

4 接種密度的選擇

NSCs的生長密度對于其自身的增殖有重要的影響[13]。如果細胞密度過高，細胞則會聚集成團，導致營養(yǎng)供應不足，活性降低，甚至會出現(xiàn)大量死亡的狀況。如果細胞密度過低，細胞之間缺乏有效的連接，造成增殖速度減慢。因此掌握好NSCs的接種密度對于其生長十分關鍵。文獻中提及NSCs的接種密度從 1×105～1×107個/mL不等[14?16]。課題組按照1×105、1×106和1×107個/mL 3個密度進行接種，結(jié)果顯示1×106個/mL的NSCs成球速度快，神經(jīng)球數(shù)量多且狀態(tài)良好。

5 不同培養(yǎng)方法對神經(jīng)干細胞的影響

目前NSCs的培養(yǎng)方法主要有懸浮培養(yǎng)法和貼壁培養(yǎng)法。本課題組證實采用懸浮培養(yǎng)法可以形成穩(wěn)定的神經(jīng)球，有利于保持NSCs處于未分化的狀態(tài)，而采用貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)的細胞則非常容易分化。需要注意的是，在懸浮培養(yǎng)NSCs的過程中，拿、放培養(yǎng)瓶要盡量平穩(wěn)，以免造成細胞球聚集形成較大的細胞團塊。

6 不同換液方式的體會

縱觀研究人員對NSCs的換液方法，有全量換液和半量換液，其中多數(shù)采用半量換液的方法。NSCs本身就是未充分發(fā)育的細胞，所以較其他細胞而言更加脆弱，對外界環(huán)境的變化更加敏感，因此維持NSCs生長環(huán)境的相對穩(wěn)定十分重要，頻繁換液對細胞生長不利。NSCs生長不只是吸收培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分，還與NSCs自身分泌的活性物質(zhì)（如生長因子、黏附分子和趨化因子等）有關，NSCs通過自分泌或旁分泌的方式調(diào)節(jié)自身的生物學特性，因此不推薦使用全量換液的方法。而只加液不棄液的方法較半量換液更方便，因此推薦使用每2～3 d只加液不棄液（25 cm2培養(yǎng)瓶每次添加培養(yǎng)基1～1.5 mL）的方法。

7 傳代經(jīng)驗總結(jié)

7.1 傳代時機 懸浮培養(yǎng)的神經(jīng)球狀態(tài)是判斷傳代時機的重要依據(jù)。據(jù)觀察，活力好的神經(jīng)球通常透光均勻且邊緣明亮銳利。神經(jīng)球的直徑不宜過大，直徑超過300 μm的神經(jīng)球球心部較邊緣厚很多，透光性減弱，球心部顏色較邊緣暗。本課題組將NSCs培養(yǎng)至6～8 d，得到的神經(jīng)球數(shù)量多、狀態(tài)良好，適宜傳代。

7.2 傳代方法 NSCs傳代方法主要有胰酶消化法、Accutase酶消化法[17]和機械吹打法等。酶消化法操作步驟：將含有NSCs的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管，靜置15 min，去上清，加入1 mL 0.125%的胰酶或1 mL Accutase酶，消化10 min，加入培養(yǎng)基終止消化，以1 500 r/min離心10 min，去上清，加入培養(yǎng)基，調(diào)整細胞密度為1×106個/mL，接種于培養(yǎng)瓶。機械吹打法操作步驟：將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管，靜置15 min，去上清，加入培養(yǎng)基，輕柔緩慢吹打10 min，調(diào)整細胞密度為1×106個/mL，接種于培養(yǎng)瓶。原代和1代的神經(jīng)球細胞間連接不緊密，僅通過輕柔的吹打即可分離成單細胞懸液，且傳代后活細胞比例最高，成球率最高，神經(jīng)球可以保持穩(wěn)定的未分化狀態(tài)，吹打時要輕柔且避免產(chǎn)生氣泡。2代及以后神經(jīng)球通過單純機械吹打無法使其完全分離為單細胞。采用胰酶消化法不容易掌握消化時間，對細胞損傷較大，活細胞比例相對較低，再次成球率低。損傷的細胞釋放其核內(nèi)DNA，這些DNA具有很強的黏性，會將分離消化的單細胞黏附在一起。本課題組對原代和1代的神經(jīng)球采用機械吹打法進行傳代，對2代及以后的神經(jīng)球采用Accutase酶進行傳代。利用Accutase酶消化2代及以后的神經(jīng)球?qū)毎麚p傷最小，活細胞比例較高，成球率較高，神經(jīng)球狀態(tài)良好。

細胞培養(yǎng)過程中會出現(xiàn)死細胞、細胞碎片及細胞分解產(chǎn)物，如果不能及時清理這些物質(zhì)則會影響NSCs的增殖。在傳代過程中，使神經(jīng)球自然沉淀，然后去除上清液，這些物質(zhì)可以被最大程度地去除。原代培養(yǎng)的NSCs中混有一些雜細胞，經(jīng)過反復傳代培養(yǎng)后也可以被去除。

本課題組已經(jīng)穩(wěn)定傳代培養(yǎng)NSCs至第7代。馬浚寧等[18]發(fā)現(xiàn)從皮質(zhì)提取的NSCs在傳至9～11代后會出現(xiàn)神經(jīng)球貼壁的現(xiàn)象，海馬和嗅球區(qū)的NSCs也有類似現(xiàn)象，提示NSCs的懸浮特性會隨著傳代次數(shù)的增加而減弱。

8 神經(jīng)干細胞標志物的選擇

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的NSCs標志物有巢蛋白、Musashi、神經(jīng)元特異性烯醇化酶、波形蛋白1、細胞黏附分子等。大部分研究者把巢蛋白作為鑒定NSCs的標志物，巢蛋白又稱為nestin，屬于Ⅵ型中間絲蛋白，其表達具有時序性，nestin在分裂增殖能力旺盛的NSCs中高表達，在NSCs向終末細胞（神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞）分化過程中逐漸減弱，已經(jīng)廣泛應用于體外培養(yǎng)的NSCs的鑒定[19]。

9 總結(jié)

提取胎齡14 d胎鼠的大腦皮質(zhì)，采用無血清培養(yǎng)基，以1×106個/mL的密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶（接種約3.5 mL），采取懸浮培養(yǎng)法，每2～3 d加液1～1.5 mL，每6～8 d傳代1次，所得到的NSCs增殖分裂旺盛、成球率高、神經(jīng)球狀態(tài)良好，并且可以保持穩(wěn)定的未分化狀態(tài)。該方法值得參考。