李 段，王 磊，梁鵬帥，張樂宜，劉燕玲，徐 崢，宋長緒

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院/國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642）

豬偽狂犬病是由偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的一種高度接觸性傳染病。作為危害全球養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的豬傳染病之一，豬偽狂犬病引起的主要癥狀有種豬繁殖障礙，仔豬神經(jīng)癥狀、腹瀉、呼吸道疾病、生長發(fā)育受阻等。隨著各規(guī)模化豬場對豬偽狂犬病控制的高度重視、高效 gE 基因缺失疫苗的應(yīng)用、針對gE 抗體水平的長期監(jiān)測和不斷淘汰感染野毒的陽性豬，很多豬場成功實現(xiàn)了對豬偽狂犬病的穩(wěn)定控制，甚至免疫為野毒（gE）抗體陰性場[1]。但從2011年底開始，豬偽狂犬病再次在我國已經(jīng)免疫過Bartha-k61的多個豬場暴發(fā)，發(fā)病的臨床癥狀與經(jīng)典的偽狂犬一致：5%～15%懷孕母豬流產(chǎn)（本身無臨床表現(xiàn)），哺乳仔豬因神經(jīng)癥狀導(dǎo)致高死亡率（15%以上），生長育肥豬發(fā)病繼發(fā)豬胸膜肺炎或豬肺疫，導(dǎo)致死亡率達(dá)到5%～20%。發(fā)病豬群血清gE陽性率快速升高達(dá)50%～100%。田克恭等[2]研究發(fā)現(xiàn)了PRV變異株，其變異毒力增強(qiáng)，抗原性發(fā)生變化。偽狂犬野毒抗體gE陽性率呈上升趨勢，2017年雖有所降低，但仍然處于較高水平。

豬群自然感染PRV后便終生帶毒、排毒，其主要傳播途徑多樣[3]。母豬血液內(nèi)的病毒可以通過胎盤屏障傳給后代，直接感染胎兒，引起懷孕母豬流產(chǎn)等[4]。PRV的 DNA一般主要以附體的形式出現(xiàn)或插入處于潛伏感染狀態(tài)下神經(jīng)元細(xì)胞的染色體 DNA中，從而能夠長期潛伏在豬群中[5]。PRV感染與免疫抗體水平的研究結(jié)果顯示，它們之間呈負(fù)相關(guān)，這對于該病防控起到重要作用[6]。目前有關(guān)豬群帶毒、排毒與PRV抗體之間關(guān)系的研究幾乎沒有。本研究通過對豬群PRV排毒情況和 gE與gB抗體水平的監(jiān)測，分析它們之間的關(guān)系，以期根據(jù)監(jiān)測結(jié)果制定綜合防控措施，更好地遏制豬場內(nèi)偽狂犬病的流行。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 血清樣品 2014年5月，采集廣東省某規(guī)?；i偽狂犬病陽性豬場不同階段豬群的血清樣品 224份，同時采集相應(yīng)豬群中精液樣品 7份、乳汁樣品 24份、唾液樣品82份、鼻拭子樣品 177份、肛拭子樣品177份、臍帶血樣品 10份，樣品經(jīng)處理后放于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

2014年6月，采集廣東省某規(guī)模化豬偽狂犬病陰性豬場不同階段豬群的血清樣品72份，同時采集相應(yīng)豬群中鼻拭子樣品74份、肛拭子樣品74份、唾液樣品74份、乳汁樣品9份、精液樣品5份，樣品經(jīng)處理后放于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

記錄各豬場主要的免疫程序，各豬場均使用gE基因缺失疫苗免疫。

1.1.2 試劑 偽狂犬病毒gE抗體測定采用gEELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗）診斷試劑盒（購自美國IDEXXR公司，批號為LK935）；偽狂犬病毒gB抗體測定采用Biochek Aujeszky gB（PRV-gB）診斷試劑盒（購自天之泰生物公司，批號為FS6014）；病毒DNA/RNA提取試劑盒購自Magen公司產(chǎn)品；Ex Taq酶、DNA Marker DL2000等購自TaKaRa公司。

1.1.3 引物 根據(jù)GenBank上公布的gE基因序列，從gE的ORF中選取一段保守序列用以PRV-gE的核酸檢測，利用Primer5軟件設(shè)計特異性引物，引物序列如下：gE-F：5’-GACCATG CGGCCCTTTCTGC-3’；gE-R：5’-GGTCCACCG GGCGCAGGCACTGC-3’，預(yù)期目的片段長度890 bp。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品處理 不加抗凝劑收集的血液樣品，室溫靜置2～6 h后，以4 000 r/min離心15 min，取上清液，置1.5 mL EP管中；對于沒有血清分離條件的地區(qū)，室溫靜置，讓其自然析出血清；-20℃保存血清待檢。

鼻拭子和肛拭子用加入抗生素的PBS對拭子進(jìn)行懸浮，然后8 000 r/min離心5 min，抽取250 μL，用以提取病毒DNA。剩余的樣品置于-80℃保存。

1.2.2 血清中PRV gE、gB抗體檢測 （1）PRV gE抗體水平檢測：使用PRV gE-ELISA抗體檢測盒對待檢血清樣品中的PRV gE抗體水平進(jìn)行檢測，具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

（2）PRV gB抗體水平檢測：使用Biochek Aujeszky gB抗體檢測試劑盒對待檢血清樣品中的PRV gB抗體水平進(jìn)行檢測，具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.3 病毒DNA提取 取250 μL處理好的樣品（如血清、初乳、組織勻漿液、拭子等）置于裝有20 μL蛋白酶K的離心管中，其余步驟按照PRV核酸提取試劑盒說明書進(jìn)行，提取的PRV DNA置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 PRV gE基因片段檢測 PCR反應(yīng)體系：2×Taq Buffer12.5 μL，引物（10 μmol/L）各 1 μL，模板 DNA 2 μL，加 ddH2O 至 25 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s、56℃退火30 s、72℃延伸50 s，34個循環(huán)；最后72℃終延伸12 min。PCR產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠電泳分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同階段豬群血清樣品的PRV gE抗體檢測結(jié)果

通過gE-ELISA方法對2014年5月和6月采集自廣東省某陽性豬場和某陰性豬場不同階段豬群的血清樣品進(jìn)行PRV-gE抗體檢測，結(jié)果檢出陽性豬場PRV-gE野毒抗體陽性的血清樣品共127份，總陽性率為56.7%（表1），從表1可以看出，除了1周齡仔豬、5周齡保育豬和哺乳母豬偽狂犬野毒抗體為陰性外，其他階段豬群的gE抗體都有陽性，其中后備母豬、一胎母豬和經(jīng)產(chǎn)母豬的平均陽性率為93.6%，懷孕和空懷母豬的平均陽性率為23.1%，公豬的陽性率是12.1%，6周齡保育豬的陽性率為70%，8周齡保育到育肥豬陽性率偏高，52.7%～100%不等，其中16～24周齡育肥豬的陽性感染率則高達(dá)100%，表明陽性豬場不同階段豬群普遍存在PRV野毒感染，其中育肥豬和母豬感染最嚴(yán)重。1周齡、5周齡為陰性，可能是母源抗體起到比較好的保護(hù)效果，但也有野毒感染的影響，比如在6周齡抗體出現(xiàn)異常升高，可能是在保育舍后PRV再次感染，導(dǎo)致抗體水平較高。利用gE-ELISA抗體檢測試劑盒檢測PRV陰性豬場血清樣品72份，檢測結(jié)果均為gE抗體陰性，表明陰性豬場豬群沒有PRV野毒感染，處于正常水平。

表1 陽性場不同階段豬群PRV gE抗體檢測結(jié)果

2.2 不同階段豬群血清樣品PRV gB抗體檢測結(jié)果

檢測陽性豬場和陰性豬場不同階段豬群血清中的PRVgB抗體，結(jié)果顯示，陽性場不同階段豬群PRV-gB陽性率都很高，gB抗體的總陽性率為88.8%（表2），從1周齡仔豬到10周齡育肥豬，gB抗體陽性率逐漸降低，之后迅速升高，這一情況與母源抗體消退趨勢基本一致，之后升高應(yīng)該與疫苗免疫有關(guān)。陰性不同階段豬群gB抗體的總陽性率為38.9%（表3），顯著低于陽性場，仔豬到12周齡育肥豬，gB抗體陽性率逐漸降低，14周齡育肥豬gB抗體又達(dá)到較高水平，之后逐漸降低，這個趨勢符合母源抗體和免疫抗體消長規(guī)律。陰性場公豬、一胎母豬、初產(chǎn)母豬、經(jīng)產(chǎn)母豬群的抗體陽性率都為100%，且gE抗體陰性，說明該場種豬群的gB抗體來自疫苗免疫，免疫效果較好，抗體水平高且整齊；整體上陰性場各階段豬群抗體陽性率普遍較低，且gE抗體陰性，說明野毒感染對豬群抗體水平變化產(chǎn)生了顯著影響。

表2 陽性場不同階段豬群PRV gB抗體檢測結(jié)果

表3 陰性場不同階段豬群PRV gB抗體檢測結(jié)果

2.3 不同階段豬群樣品PRV gE抗原檢測結(jié)果

用PCR方法對陰性場不同階段豬群采集的樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，陰性豬場的血清、初乳、精液、唾液、鼻拭子和肛拭子等共308份樣品均未檢測出PRV抗原陽性，說明該場沒有PRV野毒感染。而陽性場中生產(chǎn)過的母豬、3周齡仔豬到10周齡育肥豬、20周齡到22周齡育肥豬檢測到了PRV抗原（圖1）。針對不同類別樣品而言，3周齡仔豬唾液樣品陽性率為10%；一胎和經(jīng)產(chǎn)母豬鼻拭子樣品陽性率分別為20%和18.3%，3周齡仔豬到10周齡育肥豬陽性率從8.3%升高到30.8%；經(jīng)產(chǎn)母豬肛拭子樣品陽性率為9.1%，3周齡仔豬到10周齡育肥豬陽性率為7.7%～16.7%不等（表4）。不同樣品比較來看，臍帶血的陽性檢出率最高、達(dá)80%，其次是初乳、33.3%，鼻拭子、肛拭子、唾液、血清陽性率較低，精液為陰性（圖2）。以上結(jié)果表明，PRV帶毒主要在母豬和仔豬、保育豬階段，其排毒方式多樣，以臍帶血、初乳為主，也就是說PRV垂直傳播風(fēng)險極高。

圖1 陽性場不同階段豬群PRV抗原陽性率比較

圖2 陽性場豬群不同樣品中PRV抗原陽性率比較

表4 不同階段豬群不同樣品中PRV抗原檢測結(jié)果

2.4 豬偽狂犬病排毒情況與gE、gB抗體之間的關(guān)系

本研究的陽性場、陰性場均免疫了gE缺失疫苗，因此gE抗體代表了野毒感染情況，gB代表母源抗體或免疫抗體水平。以陰性場為參考，分析豬偽狂犬病排毒情況與gE、gB抗體之間的關(guān)系，結(jié)果如圖3所示，豬偽狂犬病排毒對gE、gB抗體的影響顯著，gE抗體變化趨勢與病毒感染呈現(xiàn)一定的正相關(guān)性，有豬群，如后備母豬gE陽性率100%，gE抗原陽性率為0%，這可能是由于使用普通PCR方法不夠靈敏造成的。對于gB抗體而言，陰性場gB抗體只是代表了母源抗體和免疫抗體消長情況，但是對于陽性場，gB還受到了病毒感染的影響，表現(xiàn)在1周齡仔豬到10周齡育肥豬階段，此時應(yīng)該是母源抗體消退，但陽性場gB抗體表現(xiàn)異常，到10周齡時，其陽性率依然高達(dá)40%；另外就是表現(xiàn)在育肥階段，免疫抗體應(yīng)該較低，陽性場gB抗體陽性率卻異常高，甚至達(dá)100%，因此，豬偽狂犬病排毒對gB抗體的影響主要是使豬群在各階段抗體水平偏高。

圖3 陽性場豬偽狂犬病排毒情況與gE、gB抗體之間的關(guān)系

3 結(jié)論與討論

豬場豬偽狂犬病的快速轉(zhuǎn)陽給廣東省養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。豬偽狂犬病毒可以感染各個階段豬群，易感豬、免疫豬都可能潛伏感染或隱性感染情形[7-8]，這為該病防治造成極大困難。使用gE 基因缺失疫苗不僅有效控制PRV的流行，也為血清學(xué)區(qū)分免疫豬和自然感染豬提供便利[9]。本次研究以gE缺失疫苗免疫豬群為對象，以PRV野毒陰性場為參考，分析PRV野毒排毒對gE抗體、gB抗體水平的影響。

研究發(fā)現(xiàn)，陰性豬場豬群血清樣品的PRV gE抗體全部為陰性，而陽性場總體陽性率高達(dá)56.7%。陰性場PRV gB抗體變化與劉明亞等[10]報道一致，總體上看，新生仔豬PRV抗體水平較高，之后緩慢下降，8周齡疫苗免疫后，抗體呈加速下降，陰性場在3周齡和8周齡時出現(xiàn)大幅度下降，這也與朱玲等[11]的報道一致，在2～3周齡、5～8周齡2次出現(xiàn)較大幅度下降。相比之下，陽性豬場PRV gB抗體出現(xiàn)明顯異常，尤其是16～24周齡育肥豬階段，陽性率達(dá)100%，1周齡仔豬到10～12周齡育肥豬，抗體陽性波動下降，但最低仍有40%。育肥豬高水平的gE抗體陽性更能客觀地反映出豬偽狂犬病感染的實際情況，由于豬偽狂犬病 gE 抗體在90～120日齡會慢慢消失[12]，因此種豬和育肥豬的野毒抗體呈陽性是PRV感染導(dǎo)致的結(jié)果，再根據(jù)排毒檢測結(jié)果推斷，這與PRV在3周齡和10～12周齡高感染率有直接關(guān)系。

本研究結(jié)果顯示，后備母豬、一胎母豬和經(jīng)產(chǎn)母豬的野毒抗體陽性率為93.6%，在16～24周育肥豬群中，PRV野毒抗體陽性率高達(dá)98%，且通過核酸檢測結(jié)果可以看出，種豬主要通過初乳和臍帶血進(jìn)行排毒，并且本試驗已經(jīng)從初乳樣品中分離到了PRV[13]，被感染的育肥豬群則可以通過口鼻及生殖道分泌物進(jìn)行排毒，而公豬gE抗體陰性但能在血清中檢測到PRV，說明血液也是PRV的排毒途徑之一。這一檢測結(jié)果表明PRV在該陽性場的種豬舍和肥育舍特別活躍，gE抗體水平介于0.04～0.05之間的帶毒豬能夠通過不同途徑向外排毒、散毒，因此可以說帶毒豬是陽性豬場內(nèi)病毒不斷循環(huán)的警示器。

自2011年起，豬偽狂犬病的陽性豬場明顯增多，而近年來幾乎所有的規(guī)?；i場都通過使用 gE 基因缺失疫苗對豬群進(jìn)行強(qiáng)化免疫。從周緒斌等[1]、邱美珍等[14]的偽狂犬病野毒抗體調(diào)查報告得知，使用gE基因缺失疫苗進(jìn)行免疫獲得了較理想的效果。因此，定期的疫苗免疫接種仍然是當(dāng)前控制病毒性疫病的主要辦法，免疫前后定期監(jiān)測豬偽狂犬病 gB 抗體滴度是檢測疫苗是否能有夠效保護(hù)豬群不受感染的方法[15]。

綜上分析，PRV排毒和豬群gE抗體水平呈現(xiàn)一定的正相關(guān)性，并干擾gB抗體，主要表現(xiàn)在8～12周齡、16～24周齡育肥階段豬群gB抗體異偏高，波動較大。PRV感染豬群后，排毒途徑多樣，但是以母豬帶毒、排毒感染仔豬危害最大。豬偽狂犬病野毒陽性場和陰性場疫苗免疫應(yīng)該根據(jù)其血清學(xué)檢測結(jié)果及陰、陽性場的特殊性制定合理的免疫程序，對于陽性場還要狠抓野毒攻擊點，以達(dá)到減少損失的目的。