張亞娟，王倩，龍瑜菡，李璇，李光菊，鄧綱，劉飛虎

（云南大學農(nóng)學院，昆明650091）

大麻（Cɑnnɑbis sɑtivɑL.）為大麻科、大麻屬一年生草本綠色纖維植物，大麻可密植、生物量大、生長快。大麻纖維可制成許多高檔紡織品，植株全桿可替代木材造紙、制造建筑材料，大麻籽可作為食品、藥品和飼料，大麻籽榨出的油還可作為化工原料、燃料，大麻的根、花、葉、種子皆可制成藥品，葉、枝梢、果殼皆可作為良好的殺蟲防病的土壤肥料［1-2］，故大麻已成為當今適應社會綠色、環(huán)保、經(jīng)濟需求的綠色經(jīng)濟作物之一。

近年來，隨著城市現(xiàn)代化、工業(yè)化的發(fā)展，以及化肥濫用等現(xiàn)象加劇，土壤重金屬銅進入環(huán)境而導致的污染不斷惡化，尤其通過食物鏈對動植物以及人類產(chǎn)生重大危害［3-4］。因此，解決重金屬銅污染問題已是當今環(huán)境可持續(xù)發(fā)展和人類綠色健康需求的迫切問題。篩選、培育出吸收銅能力強、生物量大、生長快、且不進入食物鏈的植物是生物修復的一項重要任務［5］。有研究［6-7］表明，大麻已成為修復重金屬污染土壤的候選植物之一，其具有生長快，生物量大，經(jīng)濟價值高的特點。作物的萌發(fā)期是生長起始階段，直接關系到以后的生長發(fā)育。前人［8-9］對萌發(fā)期的“云麻2號”進行4種重金屬（Cu、Zn、Pb、Cd）處理，發(fā)現(xiàn)云麻2號對這4種重金屬的抗性不同，還發(fā)現(xiàn)萌發(fā)期不同品種大麻耐鉛性有差異。但由于現(xiàn)今大麻品種繁雜，品種間耐重金屬差異顯著，缺乏科學系統(tǒng)的重金屬銅耐性評價體系，進而嚴重影響大麻耐銅品種選育、生物修復備選經(jīng)濟作物推廣，故進行大麻耐銅性評價具有重要的科學實踐意義。因此，本研究開展了大麻萌發(fā)期重金屬銅耐性研究。

本試驗針對重金屬銅污染問題，對不同品種萌發(fā)期大麻進行不同濃度銅（Cu2+）處理，并進行相關指標測量，以隸屬函數(shù)評價不同品種間的耐銅性差異，旨在為篩選耐銅大麻品種以及利用大麻作物修復重金屬銅污染土壤提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

廣西的巴馬火麻（BM）、云南的云麻 1號（Y1）、云麻5號（Y5）、云麻6號（Y6）、云麻 7號（Y7）、云晚6號（YW6）、安徽的皖麻1號（W1）、山西的晉麻1號（J1）和黑龍江的慶麻1號（Q1）9個大麻品種。

1.2 試驗方法

銅離子 Cu2+（CuSO4·5H2O）濃度設置為0（CK）、50、100、150、300、600、900 mg/L。

先將9個大麻品種種子用蒸餾水沖洗干凈表皮，然后用吸水紙吸干大麻種子表面水分，再挑選外型優(yōu)良一致的30粒種子均勻置于培養(yǎng)皿（直徑9 cm）內(nèi)，最上面鋪一層濾紙，下鋪三層吸水紙，加入15 mL 7個不同濃度梯度的銅溶液，設置3個重復，將培養(yǎng)皿置于25℃光照培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)3 d進行催芽；后4 d置于光照12 h/d、光強8000 lx、光照期溫度25℃，黑暗期12 h/d、溫度20℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，由于每天水分蒸發(fā)，期間補充重金屬溶液，以保持發(fā)芽水分和重金屬銅的質(zhì)量濃度。以胚根長大于大麻種子長度一半為發(fā)芽標準［10］，每天觀察記錄發(fā)芽種子數(shù)，共統(tǒng)計7 d，第3天統(tǒng)計發(fā)芽勢；第7天統(tǒng)計發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、根長（主根）、芽長、鮮重，計算根長抑制指數(shù)（主根）、芽長抑制指數(shù)，以側(cè)根長≥0.5 mm統(tǒng)計側(cè)根數(shù)量［11］。

相關計算公式如下［12-13］：

其中：GI：發(fā)芽指數(shù)；Gt：指定時間（天）的發(fā)芽種子數(shù)；Dt：相應的發(fā)芽試驗時間（天）。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗中各數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件進行記錄統(tǒng)計，利用SPSS17.0軟件進行單因素（Duncan法）方差分析，用Excel 2010軟件制作圖表。

1.4 不同大麻品種耐銅性綜合評價

對9個大麻品種進行耐銅性評價。首先將各項指標值換算成相對值（相對值=處理值/對照值），然后按下面公式計算隸屬函數(shù)值。如果各指標相對值與大麻耐性呈正相關，就代入（6）式進行計算，反之則代入（7）式進行計算。將各品種大麻各指標的耐性隸屬函數(shù)值累加起來，求其平均值［14-15］。

隸屬函數(shù)值計算公式為：

式中：xij表示i品種j個相對指標的隸屬函數(shù)值；xj為第j個指標的隸屬函數(shù)值；xjmax和xjmin分別表示所有品種第j個相對指標的最大值和最小值；再根據(jù)平均隸屬函數(shù)X值的大小對9個品種進行耐性鑒定，即X≥0.7為1級高耐型，0.50≤X≤0.70為2級中耐型，0.30≤X<0.50為3級低耐型，X<0.3為 4級不耐型［9］。

2 結(jié)果與分析

2.1 銅脅迫對不同大麻品種種子萌發(fā)的影響

2.1.1 銅脅迫對大麻發(fā)芽勢的影響

由表1可看出，除Y6、Y7、W1在低濃度發(fā)芽勢有所增加外，其余品種發(fā)芽勢隨著銅濃度增加呈下降趨勢，表現(xiàn)出銅對大麻發(fā)芽勢抑制效果顯著。Y6、W1、Y7在銅濃度為50 mg/L時較之對照發(fā)芽勢升高，其中Y6、Y7在銅濃度至100 mg/L時發(fā)芽勢仍較之對照上升或差異不顯著，但Y6、W1、Y7的發(fā)芽勢隨著銅濃度高于150 mg/L時皆較之對照顯著下降，表現(xiàn)為“低促高抑”現(xiàn)象。其余6個品種發(fā)芽勢隨著銅濃度增加呈下降趨勢，且與對照差異顯著。

表1 不同濃度銅對大麻發(fā)芽勢的影響Tab.1 Effects of different Cu2+concentration on the germination energy of hemp seeds %

2.1.2 銅脅迫對大麻發(fā)芽率的影響

由表2可看出，除Y6、Y7在低濃度發(fā)芽率有所增加外，其余品種發(fā)芽率隨著銅濃度增加呈下降趨勢，表現(xiàn)出銅對9個大麻品種發(fā)芽率抑制效果顯著。Y6在銅濃度50、100 mg/L時較之對照發(fā)芽率有所增加，Y7在銅濃度50 mg/L時較之對照發(fā)芽率增加且差異顯著，而后Y6、Y7發(fā)芽率隨著銅濃度的增加而下降。當銅濃度為50 mg/L時，Q1、Y1發(fā)芽率顯著低于對照，J1、W1、Y5、YW6在銅濃度100 mg/L時發(fā)芽率開始顯著低于對照，Y6、Y7在銅濃度為150 mg/L時發(fā)芽率開始顯著低于對照。

表2 不同濃度銅對大麻發(fā)芽率的影響Tab.2 Effects of different Cu2+concentration on the germination rate of hemp seeds %

2.1.3 銅脅迫對大麻發(fā)芽指數(shù)的影響

由表3可看出，除Y6、Y7在低濃度50 mg/L、100 mg/L發(fā)芽指數(shù)較之對照有所增加外，其余品種發(fā)芽指數(shù)隨著銅濃度增加呈下降趨勢，表現(xiàn)出銅對大麻發(fā)芽指數(shù)抑制效果顯著。BM、Y1、Q1在所有銅濃度下發(fā)芽指數(shù)皆顯著低于對照；Y6、J1、W1、Y5、Y7、YW6在銅濃度為50 mg/L時與對照差異不顯著，可見 Y6、J1、W1、Y5、Y7、YW6對低濃度銅有一定耐性。

表3 不同濃度銅對大麻發(fā)芽指數(shù)的影響Tab.3 Effects of different Cu2+concentration on the germination index of hemp seeds

2.1.4 銅脅迫對大麻活力指數(shù)的影響

由表4可看出，除Y7在低濃度活力指數(shù)較之對照有所增加外，其他品種大麻活力指數(shù)總體隨著銅濃度的上升呈下降趨勢，表現(xiàn)出銅對9個大麻品種活力指數(shù)抑制效果顯著。除Y7在銅濃度50 mg/L時活力指數(shù)顯著高于對照外，其余8個品種在銅濃度50 mg/L時活力指數(shù)顯著低于對照。

2.2 銅脅迫對大麻芽苗生長的影響

2.2.1 銅脅迫對大麻根長的影響

由表5可看出，各個大麻品種的根長均隨著銅濃度的上升呈下降趨勢，表現(xiàn)出銅對根長抑制效果顯著。供試大麻品種在各銅濃度下根長均低于對照，彼此間差異顯著。Q1在50～900 mg/L濃度范圍內(nèi)受抑制效果無顯著差別，說明50 mg/L即對Q1表現(xiàn)出強烈的抑制作用，以至于再增加濃度后抑制空間不大。

表4 不同濃度銅對大麻活力指數(shù)的影響Tab.4 Effects of different Cu2+concentration on the vigor index of hemp seeds

表5 不同濃度銅對根長（主根）的影響Tab.5 Effects of different Cu2+concentration on the radice length of hemp germination cm

2.2.2 銅脅迫對大麻芽長的影響

由表6可看出，各個大麻品種的芽長總體隨銅濃度的上升呈下降趨勢，表現(xiàn)出銅對9個大麻品種芽長的抑制效果。J1在銅濃度50 mg/L時芽長較對照顯著增加，說明低濃度對J1的芽長有促進作用，Y7芽長在銅濃度50 mg/L、100 mg/L時與對照差異不顯著，可見J1、Y7有一定的耐銅性；BM、Y1、Y6、W1、Y5、Q1、YW6在低銅濃度50 mg/L時芽長皆顯著低于對照?？傮w上可見高銅濃度600～900 mg/L對芽長強烈抑制，使之難有下降空間，同時同一品種的芽長對不同銅濃度處理反應有所差異，不同品種之間的芽長對同一銅濃度處理反應有所差異。

2.2.3 重金屬銅對大麻芽苗根長與芽長抑制指數(shù)的差異性的影響

由表7可知，總體上隨著銅濃度增加根長抑制指數(shù)、芽長抑制指數(shù)增加，9個大麻品種各處理濃度根長抑制指數(shù)大于芽長的抑制指數(shù)，說明銅脅迫對根長的抑制作用比對芽長強。在銅濃度為600 mg/L時根長抑制指數(shù)與芽長抑制指數(shù)都高達0.7以上，J1在低銅濃度50 mg/L時芽長抑制指數(shù)為-0.18，而后隨脅迫增加芽長受抑制，可見低銅濃度對J1芽長有促進作用。

表6 不同濃度銅對芽長的影響Tab.6 Effects of different Cu2+concentration on the hypocotyl length of hemp germination cm

表7 不同濃度銅對大麻品種根長（主根）、芽長抑制指數(shù)的影響Tab.7 Effects of different Cu2+concentration on the inhibition index of root and shoot length of 9 varieties

2.2.4 銅脅迫對大麻芽苗鮮重的影響

由表8可知，各個品種鮮重都隨著銅濃度增加呈下降趨勢，表現(xiàn)出銅對9個大麻品種鮮重抑制效果顯著。當銅濃度≥50 mg/L時，BM、Y1、Y6、W1、Y5、Q1、Y7、YW6鮮重不斷減少且顯著低于對照，J1在銅濃度50～150 mg/L時鮮重與對照差異不顯著，當銅濃度≥300 mg/L時顯著低于對照。

表8 銅濃度對芽苗鮮重的影響Tab.8 Effects of different Cu2+concentration on the fresh weight of hemp germination g/10株

2.2.5 銅脅迫對大麻芽苗側(cè)根數(shù)量的影響

如表9所示，各個品種側(cè)根數(shù)量隨著銅濃度增加呈下降趨勢，表現(xiàn)出銅對9個大麻品種側(cè)根數(shù)抑制效果顯著。各個品種在銅濃度為50 mg/L時側(cè)根數(shù)顯著低于對照，在銅濃度600 mg/L已無側(cè)根產(chǎn)生。

表9 不同濃度銅對側(cè)根數(shù)量的影響Tab.9 Effects of different Cu2+concentration on the lateral root number of hemp germination

2.3 不同大麻品種銅耐性評價

選擇對大麻發(fā)芽、根、芽、側(cè)根生長具有顯著限制性作用的銅濃度（600 mg/L），以相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽指數(shù)、相對活力指數(shù)、相對根長、相對芽長為評價指標，采用隸屬函數(shù)法對各品種耐銅性進行評價，結(jié)果如表10所示。根據(jù)隸屬函數(shù)的大小，得到9個品種銅耐性強弱：Y6>YW6>Y7>J1>Y5>W1>BM>Y1>Q1。

根據(jù)隸屬函數(shù)的標準分類結(jié)果如下（表11），得到9個品種銅耐性強弱：Y7、Y6、YW6為高耐銅型，J1、Y5、W1為中耐銅型，BM、Y1、Q1為低耐銅型。

表10 銅（600 mg/L）脅迫下大麻各相對指標的隸屬函數(shù)值Tab.10 The subordinative values of relative values germination indexes under Cu2+

表11 9個大麻品種的平均隸屬函數(shù)銅耐型分類Tab.11 Average membership function tolerance classification for 9 varieties

3 討論與總結(jié)

本試驗中隨著銅濃度的增加，9個大麻品種的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)總體呈下降趨勢，特別是高濃度銅脅迫對大麻萌發(fā)抑制作用強烈，該研究結(jié)果與張文娟等［16］發(fā)現(xiàn)高濃度重金屬銅脅迫抑制萌發(fā)過程相一致。原因可能是銅抑制了種子萌發(fā)所需要的淀粉酶和蛋白酶的活性，降低了貯存物質(zhì)的分解速度，導致種子萌發(fā)所需物質(zhì)和能量的供給受阻，從而降低了萌發(fā)率［17-18］。

隨著銅濃度的增加，9個大麻品種的根長、芽長、鮮重、側(cè)根數(shù)量顯著低于對照，重金屬銅對根長的抑制作用比芽長抑制作用大，表明銅對9個大麻品種萌發(fā)期的生長抑制作用強烈且對根長的抑制作用比芽長大，與王翰等［19］的試驗結(jié)果一致?？赡茉蚴欠N子萌發(fā)胚根最先突破種皮吸水，使胚根的重金屬累積量以及受脅迫時間比胚芽大，重金屬離子被根尖細胞吸收并累積，誘發(fā)細胞產(chǎn)生自由基［20-21］，當自由基產(chǎn)生量超過根系自身的抗氧化酶的清除能力時，就會對根系產(chǎn)生傷害，使根系活力下降［22］，植物根部損傷嚴重，主根伸長受到抑制，根尖出現(xiàn)硬化，生長點細胞分裂受到抑制，根毛數(shù)量減少甚至枯死［23］。同時，根系生長受到抑制后，胚芽的生長、鮮重均發(fā)生不同程度的下降，其中以根長下降最為劇烈。不同大麻品種對高濃度銅脅迫的表現(xiàn)不盡相同，在一定程度上出現(xiàn)分化，各個品種基因的差異導致耐性不同［24］，是基因與環(huán)境的綜合表現(xiàn)［9］。本研究采用隸屬函數(shù)法對大麻品種進行綜合評價，消除了個別指標帶來的片面性，用隸屬函數(shù)法將本次所選9個大麻品種分為3種不同耐銅型大麻品種。

由于植物生長發(fā)育在萌發(fā)期和苗期所需條件和營養(yǎng)物質(zhì)不同，應對脅迫方式可能存在差異，萌發(fā)期耐性不能完全代表植物總體耐性，最好結(jié)合某些物種苗期耐性進行跟蹤試驗，同時開展重金屬復合影響試驗，以及進一步深入研究其作用機理，從而指導實踐。