洪世忠，施哲媛，何 帆，張 盛，陳衛(wèi)東

(安徽中醫(yī)藥大學，安徽 合肥 230012)

左歸飲是滋陰補腎的常用方劑，出自《景岳全書》，由熟地黃、山藥、枸杞子、山茱萸、茯苓和炙甘草組成。方中熟地黃是君藥，味甘，性微溫，歸肝腎經(jīng)，具有補血滋陰、填精益髓的功效；山茱萸是臣藥，其味酸、澀，性微溫，歸肝、腎經(jīng)。左歸飲在臨床上應用廣泛，對圍絕經(jīng)期綜合征、足跟痛、干燥綜合征、眩暈證等疾病均有良好療效[1-8]，尤其能改善圍絕經(jīng)期綜合征的臨床癥狀，具有延緩衰老的作用[9]。目前，鮮有左歸飲對細胞色素氧化酶P450在體內(nèi)代謝活性影響的文獻報道[10]。CYP2是細胞色素氧化酶P450的主要組成之一，參與43%的藥物代謝[11]，且有報道表明左歸飲或其組分與Cyp2b6、Cyp2c8、Cyp2c9活性密切相關[12-14]。大鼠體內(nèi)與之對應的酶是Cyp2b1、Cyp2c7和Cyp2c11[15]?；诖耍緦嶒灢捎肅ocktail探針藥物法[16]，分別選用安非他酮、奧美拉唑[17]、阿莫地喹3種探針藥物，研究左歸飲對大鼠肝臟中主要代謝酶活性的影響，為臨床合理用藥提供參考。

1 材料

1.1 藥材與試劑 熟地黃(河南，批號 161216)、山茱萸(浙江，批號 1701161)，炙甘草(甘肅，批號 160228)、山藥(河南，批號 161223)、茯苓(安徽，批號 160506)、枸杞子(寧夏，批號 161017)。以上藥材飲片均由安徽普仁中藥飲片有限公司提供，所有藥材經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學俞年軍教授鑒定。超純水：安徽中醫(yī)藥大學自制；甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)：上海星可高純?nèi)軇┯邢薰尽?/p>

1.2 儀器 Agilent 1290 Infinity超高效液相色譜儀：美國Agilent公司；AB SCIEX4500三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國AB SCIEX公司；AB135-S電子分析天平：德國METTLER TOLEDO公司。

1.3 動物 32只SD雄性大鼠，體質(zhì)量180～220 g，由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心[生產(chǎn)許可證號為SCXK(皖)2011-002]提供。飼養(yǎng)環(huán)境溫度(25±2)℃，濕度為50%±10%。

2 方法

2.1 左歸飲供試品的制備 根據(jù)《景岳全書》記載，稱取熟地黃(9 g)、山藥(6 g)、枸杞子(6 g)、炙甘草(3 g)、茯苓(4 g)、山茱萸(3 g)。按傳統(tǒng)湯劑煎煮工藝，藥材煎煮前用10倍水浸泡30 min，待煮沸后開始計時，溫火煎30 min，后將藥液倒出；另加6倍量水煮沸后開始計時，20 min后合并兩次藥液，濃縮至生藥量為1.0 g/mL。

2.2 溶液配制 分別精密稱取安非他酮、奧美拉唑、阿莫地喹標準品12.77、12.07、11.96 mg，置于50 mL容量瓶中，精密量取0.5 mL無水乙醇加入容量瓶中，用生理鹽水定容至刻度，混勻，超聲，配成0.2 mg/mL的Cocktail混合探針藥物溶液?，F(xiàn)配現(xiàn)用，給藥劑量為1.0 mg/kg。

2.3 內(nèi)標溶液配制 精密稱取格列苯脲標準品4.00 mg置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混勻，配成400 μg/mL格列苯脲溶液，精密吸取適量，甲醇溶解，渦旋混勻，配成500 ng/mL內(nèi)標格列苯脲溶液。

2.4 動物給藥及血樣采集 將32只SD雄性大鼠隨機分為4組，每組8只，分別為左歸飲高劑量(31 g/kg)、中劑量(20.67 g/kg)、低劑量(13.78 g/kg)組和空白對照組。每天清晨按高、中、低劑量灌胃給予左歸飲溶液，空白組每日清晨按200 g/mL給予生理鹽水灌胃，連續(xù)給藥14 d，第14天給藥后30 min，每一組均按1.0 mg/kg給藥劑量尾靜脈注射Cocktail探針藥物非那西丁、安非他酮、阿莫地喹混合溶液。在給予大鼠Cocktail探針藥物混合溶液后3、5、10、15、30、45 min，1、2、4、6、8 h，分別由眼底靜脈叢取血0.2 mL至肝素化離心管中，3 500 r/min離心10 min分離血漿，貯存于-80 ℃冰箱待測。

2.5 血漿樣品處理方法 精密量取血漿樣品100 μL置于離心管中，加入10 μL內(nèi)標格列苯脲溶液，再加入300 μL甲醇，渦旋10 min，15 000 r/min離心15 min，取上清液100 μL于進樣小瓶中，進樣量為2 μL。

2.6 色譜和質(zhì)譜條件

2.6.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動相：0.1%甲酸水溶液(A相)-乙腈(B相)；梯度洗脫：0.01～1 min為90% A→20% A，1～1.3 min為20% A，1.3～2.0 min為20% A→5% A,2.0～3.0 min為5% A→10% A，3.0～3.5 min為10% A，3.5～5 min為10% A→90% A；流速為0.2 mL/min；進樣量為5 μL；柱溫為30 ℃。

2.6.2 質(zhì)譜條件 離子化方式：電噴霧離子化(ESI)，多反應離子檢測(MRM)，正離子模式檢測；毛細管電壓：3.60 kV；離子源溫度：400 ℃；去溶劑化溫度：500 ℃；噴霧氣為氮氣，碰撞氣為氬氣。安非他酮m/z為240.0/183.9，奧美拉唑m/z為346.1/197.9，阿莫地喹m/z為356.3/283.0，內(nèi)標格列苯脲m/z為493.9/169.1。

2.7 數(shù)據(jù)處理 根據(jù)不同時間點的探針藥物血藥濃度，用DAS 2.0軟件計算AUC、t1/2、CL等藥物代謝動力學參數(shù)。應用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計分析，實驗組與空白對照組的藥物代謝動力學參數(shù)比較采用t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 方法學驗證

3.1 專屬性考察 取6只大鼠的空白血漿混合液、Cocktail溶液和內(nèi)標溶液，混合的空白血漿加入Cocktail溶液、內(nèi)標溶液，大鼠灌胃左歸飲后的血漿樣品，大鼠尾靜脈注射Cocktail溶液后的血漿樣品，按“2.5”項下方法處理樣品，采用液質(zhì)聯(lián)用儀進行分析。如圖1所示，大鼠血漿中內(nèi)源性物質(zhì)基本不干擾混合探針底物及內(nèi)標的檢測，大鼠空白血漿添加Cocktail溶液與給藥后血樣的行為一致。

3.2 線性范圍考察 精密吸取大鼠空白血漿100 μL，各加入一系列不同濃度Cocktail溶液10 μL，制備成安非他酮、奧美拉唑、阿莫地喹的系列濃度血漿樣品，按“2.5”項下方法處理血漿樣品，按“2.6”項下方法進樣測定，記錄峰面積，以血漿樣品標準品濃度(ng/mL)為橫坐標(C)，對照品峰面積與內(nèi)標峰面積之比作為縱坐標(f)，繪制各底物的標準曲線，計算線性回歸方程。由實驗結(jié)果可知，安非他酮線性回歸方程為f=0.062 4C+0.207 3(r=0.998 8)，線性范圍為5～600 ng/mL；奧美拉唑的線性回歸方程為f=0.090 5C+0.173 6(r=0.998 8)，線性范圍為5～800 ng/mL；阿莫地喹的線性回歸方程為f=0.105 7C+0.066 8(r=0.999 0)，線性范圍為0.5～200 ng/mL。

3.3 精密度和準確度考察 以SD大鼠空白血漿進行精密度和準確度(即相對回收率)考察，取適量混合探針底物溶液，配制5份探針底物最低定量下限濃度(lower limit of quantitation, LLOQ)、低濃度(low concentration quality control sample, LQC)、中濃度(middle concentration quality control sample, MQC)、高濃度(high concentration quality control sample, HQC)質(zhì)控樣品，按“2.5”項下方法處理血漿樣品，按“2.6.1”項下LC-MS/MS檢測方法進樣，分別于一日內(nèi)測定及連續(xù)3 d內(nèi)測定3次，記錄峰面積，計算各探針底物峰面積與內(nèi)標峰面積的比值，代入“3.2”項下標準曲線中求得各探針底物的濃度，計算實際測定量與加入量的比值，進而計算準確度及日內(nèi)、日間精密度。結(jié)果表明，該方法測定探針底物血漿樣品的日內(nèi)及日間精密度均良好，滿足生物樣品分析要求。

3.4 基質(zhì)效應考察 取來自不同個體的大鼠空白血漿100 μL，分別加入一系列不同濃度的探針底物混合溶液10 μL，配制成含安非他酮、奧美拉唑、阿莫地喹的LQC、MQC、HQC標準添加SD大鼠的血漿樣本，每個濃度平均配制6份，之后按“2.5”項下方法處理血漿樣品，按“2.6.1”項下LC-MS/MS方法進樣測定，記錄安非他酮、奧美拉唑、阿莫地喹的峰面積均為A1。另用100 μL水代替SD大鼠空白血漿，其他步驟同上，記錄安非他酮、奧美拉唑、阿莫地喹的峰面積均為A2，則安非他酮、奧美拉唑、阿莫地喹的基質(zhì)效應均為(A1/A2)×100%。采用相同方式計算內(nèi)標格列苯脲峰面積并計算其基質(zhì)效應。由結(jié)果可知，探針底物及內(nèi)標的基質(zhì)效應均為95%～105%，即離子效應對本方法的測定結(jié)果無影響，基本滿足底物定量分析的要求。

注：A.空白血漿色譜圖；B.空白血漿加探針底物及內(nèi)標溶液色譜圖；C.大鼠尾靜脈注射探針底物后探針底物及內(nèi)標色譜圖；Ⅰ.阿莫地喹；Ⅱ.安非他酮；Ⅲ.奧美拉唑；Ⅳ.格列本脲

圖1大鼠血漿中探針底物及內(nèi)標的UPLC-MS/MS圖

3.5 穩(wěn)定性考察 血漿樣品穩(wěn)定性主要利用探針底物LQC、HQC這兩個質(zhì)控樣品濃度考察SD大鼠血漿樣品的短期穩(wěn)定性、長期穩(wěn)定性，其中短期穩(wěn)定性包括自動進樣器穩(wěn)定性、室溫放置穩(wěn)定性、反復凍融穩(wěn)定性，自動進樣器穩(wěn)定性考察的是樣品在自動進樣器中放置24 h的穩(wěn)定性，而室溫放置穩(wěn)定性考察的是樣品在室溫條件下放置2 h的穩(wěn)定性，凍融穩(wěn)定性主要考察樣品凍融3次的穩(wěn)定性，血漿樣品長期穩(wěn)定性是指血漿樣品在-80 ℃冰箱放置20 d的穩(wěn)定性。在測定安非他酮、奧美拉唑、阿莫地喹這3個儲備液穩(wěn)定性的考察中均表現(xiàn)出穩(wěn)定性良好，滿足生物樣品分析條件。

4 藥物代謝動力學參數(shù)

4.1 探針藥物的血藥濃度-時間曲線 采用高、中、低劑量左歸飲溶液對大鼠灌胃14 d后，按“2.4”項下方法操作，測得3種探針藥物的血藥濃度并獲得血藥濃度-時間曲線。

4.1.1 阿莫地喹血藥濃度-時間曲線 實驗組和空白組大鼠尾靜脈注射Cocktail探針藥物溶液之后，測得探針藥物阿莫地喹的血藥濃度，擬合的大鼠體內(nèi)平均血藥濃度-時間曲線見圖2。

圖2 阿莫地喹在大鼠體內(nèi)的平均血藥濃度-時間曲線

4.1.2 安非他酮的血藥濃度-時間曲線 實驗組和空白組大鼠尾靜脈注射Cocktail探針藥物溶液之后，測得探針藥物安非他酮的血藥濃度，擬合的大鼠體內(nèi)平均血藥濃度-時間曲線見圖3。

4.1.3 奧美拉唑的血藥濃度-時間曲線 實驗組和空白組大鼠尾靜脈注射Cocktail探針藥物溶液之后，測得探針藥物奧美拉唑的血藥濃度，擬合的大鼠體內(nèi)平均血藥濃度-時間曲線見圖4。

4.2 探針藥物的藥物代謝動力學參數(shù) 各種成分的藥物代謝動力學數(shù)據(jù)經(jīng)中國藥理學會推薦的DAS 2.0程序進行處理、擬合，計算阿莫地喹、安非他酮、奧美拉唑3種探針藥物的生物半衰期(biological half life，t1/2)、清除率(clearance，CL)、藥-時曲線下面積(area under the curve，AUC)、表觀分布容積(apparent volume of distribution，V)等。采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學分析，兩組均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗。

圖3 安非他酮在大鼠體內(nèi)的平均血藥濃度-時間曲線

圖4 奧美拉唑在大鼠體內(nèi)的平均血藥濃度-時間曲線

4.2.1 左歸飲對阿莫地喹在大鼠體內(nèi)藥物代謝動力學參數(shù)的影響 阿莫地喹為Cyp2c7酶的特異性探針底物。左歸飲高、中、低劑量組與空白組比較，阿莫地喹的主要藥物代謝動力學參數(shù)的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示左歸飲高、中、低劑量連續(xù)給藥對大鼠體內(nèi)Cyp2c7并無顯著的影響。具體藥物代謝動力學參數(shù)見表1。

表1 左歸飲對阿莫地喹在大鼠體內(nèi)藥物代謝動力學參數(shù)的影響

4.2.2 左歸飲對安非他酮在大鼠體內(nèi)藥物代謝動力學參數(shù)的影響 安非他酮為Cyp2b1酶的特異性探針底物。左歸飲高、中、低劑量組與空白組比較，安非他酮的主要藥物代謝動力學參數(shù)的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示左歸飲高、中、低劑量連續(xù)給藥對大鼠體內(nèi)Cyp2b1并沒有顯著的影響。具體藥物代謝動力學參數(shù)見表2。

4.2.3 左歸飲對奧美拉唑在大鼠體內(nèi)藥物代謝動力學參數(shù)的影響 奧美拉唑為Cyp2c11酶的特異性探針底物。左歸飲高、中、低劑量組與空白組比較，奧美拉唑的主要藥物代謝動力學參數(shù)的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示左歸飲高、中、低劑量連續(xù)給藥對大鼠體內(nèi)Cyp2c11并無顯著的影響。具體的藥物代謝動力學參數(shù)見表3。

5 討論

根據(jù)《中華人民共和國藥典》，左歸飲的給藥劑量按體表面積折算，大鼠的用藥劑量是人類臨床用藥劑量的6倍，以此計算出大鼠服用左歸飲的高、中、低劑量分別為31、20.67、13.78 g/kg。因為在臨床上左歸飲的給藥方式大多為煎服，所以本研究也采用與人體用藥方式最接近的灌胃給藥。

表2 左歸飲對安非他酮在大鼠體內(nèi)藥物代謝動力學參數(shù)的影響

表3 左歸飲對奧美拉唑在大鼠體內(nèi)藥物代謝動力學參數(shù)的影響

左歸飲水溶性成分包括多糖、馬錢苷、5-羥甲基糠醛、梓醇等[18]。復方左歸飲組成中，炙甘草的主要有效成分為甘草酸類及黃酮類化合物，補脾益氣，抗疲勞和抗氧化作用更明顯。枸杞子的主要化學成分枸杞多糖和甜菜堿，具有補肝益腎的功效。熟地黃中含有地黃苷A、地黃苷D、毛蕊花糖苷3種有效成分，能夠補血滋陰、益精填髓。山茱萸總苷有良好的抗炎和免疫抑制作用，熊果酸是山茱萸發(fā)揮抑菌作用的有效成分，其和齊墩果酸對鏈脲霉素造成的糖尿病大鼠有降血糖作用[19]，山茱萸中維生素C、維生素E和硒等有清除自由基和延緩衰老作用[20]。山藥中有效成分包含皂苷、多糖、黃酮類物質(zhì)、尿囊素等。WANG等[21]得出茯苓醇提物中主要含有羊毛甾烷型三萜如茯苓新酸B、茯苓新酸A。

本實驗采用Cocktail探針藥物法，對大鼠連續(xù)給予14 d不同劑量的左歸飲后，測定給藥組與空白組中阿莫地喹、安非他酮和奧美拉唑在大鼠體內(nèi)的血藥濃度，并計算藥物代謝動力學參數(shù)，評價左歸飲對大鼠細胞色素氧化酶P450不同亞型Cyp2b1、Cyp2c11和Cyp2c7體內(nèi)代謝活性的影響，為左歸飲的開發(fā)應用提供實驗依據(jù)。實驗結(jié)果表明，與空白組對照，高、中、低劑量的左歸飲連續(xù)給藥對Cyp2b1、Cyp2c7和Cyp2c11酶活性的影響無統(tǒng)計學意義。結(jié)果提示，左歸飲聯(lián)合配伍其他藥物使用可基本忽略其對代謝酶的影響，這也與左歸飲在臨床上廣泛的配伍應用相一致。