閆慧嬌，王志偉，林云良，高紅梅，李鋒，王曉，耿巖玲

(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)，山東省分析測(cè)試中心，山東省科學(xué)院中藥過(guò)程控制研究中心，山東 濟(jì)南 250014)

人參(Ginseng Radix et Rhizoma)為五加科人參屬植物人參(PanaxginsengC.A.Meyer )的干燥根和根莖[1]，傳統(tǒng)名貴中藥，《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品，載其“味甘，微寒，主補(bǔ)五臟，安精神，開(kāi)心益智，久服輕身延年”，中國(guó)藥典2015版載其“大補(bǔ)元?dú)?，?fù)脈固脫，補(bǔ)脾益肺，生津養(yǎng)血，安神益智”，為廣為認(rèn)可的補(bǔ)益藥之一。人參的特征性化學(xué)成分主要為四環(huán)三萜達(dá)瑪烷型人參皂苷(ginsenoside)[2]，具有改善免疫功能、提高記憶、延緩衰老、改善心血管功能等作用。

目前人參皂苷含量測(cè)量主要使用反相高效液相色譜儀或者超高效液相色譜儀，配合DAD或者ELSD檢測(cè)器，以及高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行測(cè)定[3-7]。這些分析測(cè)試方法均需要與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，且目標(biāo)物與雜質(zhì)色譜響應(yīng)值的差異，可能使其準(zhǔn)確性受到一定影響。氫核磁定量分析技術(shù)(quantitative hydrogen nuclear magnetic resonance spectroscopy)是基于核磁共振原理的一種定量分析方法，其原理是不同化學(xué)環(huán)境的氫原子的共振峰面積，只與其原子數(shù)目有關(guān)[8]。方法簡(jiǎn)單、快捷，不破壞樣品，可以不使用待測(cè)組分的對(duì)照品，而使用已知含量的普通化學(xué)物質(zhì)為參比，相比于高效液相色譜法、氣質(zhì)及液質(zhì)聯(lián)用等定量技術(shù)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。隨著核磁靈敏度的提高，定量核磁技術(shù)的準(zhǔn)確度已被廣泛用于化學(xué)對(duì)照品，中藥材等的定量分析[9-11]，先后被美、英及歐洲藥典收錄[12-13]，《中國(guó)藥典》自2010版[14]也已收錄該方法。但目前沒(méi)有運(yùn)用氫核磁定量分析技術(shù)對(duì)人參皂苷含量測(cè)定的相關(guān)報(bào)道。本研究采用核磁共振內(nèi)標(biāo)法測(cè)定了人參皂苷對(duì)照品的含量，建立了在無(wú)需使用對(duì)照品的情況下對(duì)人參皂苷進(jìn)行質(zhì)量控制和含量測(cè)定的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Bruker BioSpin 400 MHz NMR spectrometer(德國(guó)Bruker公司)；Sartorius SQP精密天平(德國(guó)Sartorius公司)；單通道可調(diào)微量移液器(德國(guó)Eppendorf公司)；Aglient 1260 HPLC(配Aglient 385 ELSD檢測(cè)器，美國(guó)Aglient公司)。

氘代二甲亞楓(氘代度>99.9%，美國(guó)CIL公司)；氘代D2O(氘代度>99.9%，美國(guó)CIL公司)；苯甲酸(Pcode 1002325760，純度99.5%，美國(guó)Sigma公司)；人參皂苷Rd對(duì)照品。人參皂苷Rd和苯甲酸的結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

圖1 人參皂苷Rd和苯甲酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of ginsenoside Rd and benzoic acid

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

核磁定量實(shí)驗(yàn)要求所有測(cè)試圖譜均在同一測(cè)試條件下完成。本實(shí)驗(yàn)核磁共振(NMR)采集條件：測(cè)定溫度25 ℃，觀測(cè)頻率400.13 MHz，脈沖序列zg，脈沖寬度11.800 0 μs，采集時(shí)間4.089 4 s，測(cè)定樣品的NMR譜圖。

考察累加次數(shù)設(shè)定為8、16、32、64、128，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示累加次數(shù)的改變對(duì)樣品定量峰與內(nèi)標(biāo)物定量峰積分面積比值無(wú)明顯影響，所以選擇累加次數(shù)32。見(jiàn)圖2a。

考察弛豫時(shí)間設(shè)定1 、3 、5、10 、20 s時(shí)被測(cè)樣品定量特征峰的峰面積，選擇峰面積不再增加的值為實(shí)驗(yàn)參數(shù)，確定弛豫時(shí)間為5 s。見(jiàn)圖2b。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

式中，ws為樣品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；wr為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)；As和ns分別為被測(cè)定樣品的定量峰積分面積及定量峰包含質(zhì)子數(shù)；Ar和nr分別為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的定量峰積分面積及定量峰包含的質(zhì)子數(shù)；Ms為被測(cè)樣品分子質(zhì)量；Mr為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的分子質(zhì)量；ms為樣品的質(zhì)量；mr為稱取的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量。

a 累加次數(shù)考察圖譜；b 弛豫時(shí)間考察圖譜。圖2 實(shí)驗(yàn)條件考察的圖譜Fig.2 Determination of experimental conditions using 1H NMR spectrum

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 氘代溶劑、內(nèi)標(biāo)物和定量峰的選擇

2.2 線性關(guān)系考察

制成6種不同濃度的待測(cè)樣品溶液，依照1.2的核磁共振采集條件，測(cè)定樣品的1H NMR譜。分別測(cè)定人參皂苷Rd和苯甲酸定量信號(hào)峰積分面積，具體結(jié)果如表1所示。

以人參皂苷Rd、苯甲酸1H NMR定量峰面積比為縱坐標(biāo)y，以人參皂苷Rd、苯甲酸質(zhì)量比為橫坐標(biāo)x做線性關(guān)系圖，得回歸方程為y=0.065 8x+0.004 5，相關(guān)系數(shù)R=0.997 8。結(jié)果表明，采用氫核磁定量技術(shù)對(duì)人參皂苷Rd的含量進(jìn)行測(cè)定，線性關(guān)系良好。

a 人參皂苷Rd部分H譜(dDMSO)；b 人參皂苷Rd和苯甲酸混合物(dDMSO)；c 人參皂苷Rd和苯甲酸混合物(dDMSO+D2O)。圖3 核磁共振氫譜法測(cè)定人參皂苷Rd含量的圖譜Fig.3 Determination of ginsenoside Rd using 1H NMR spectrum

表1 人參皂苷Rd和苯甲酸的質(zhì)量及峰面積積分值Table 1 Mass and integral value of peak area of Ginsenoside Rd and benzoic acid

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

取2.2項(xiàng)下的3號(hào)樣品，在選定的同一實(shí)驗(yàn)條件下，連續(xù)測(cè)定6次，人參皂苷Rd和苯甲酸定量峰的積分面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.97%和0.85%，表明重復(fù)性好。

2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取2.2項(xiàng)下的3號(hào)樣品，分別于0 、2、4 、6 、8 、10 h測(cè)定其人參皂苷Rd和苯甲酸定量峰的積分面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，為0.77%和0.68%，表明樣品溶液在10 h內(nèi)測(cè)定穩(wěn)定。

2.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

采用加標(biāo)回收率方法測(cè)定不同濃度人參皂苷Rd的回收率，結(jié)果顯示，120%，100%及80%的加標(biāo)量的回收率分別為98.69%，102.54%，101.01%，平均回收率為100.75%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.92%，說(shuō)明該法準(zhǔn)確性良好。

2.6 樣品測(cè)定

取3個(gè)批次的人參皂苷Rd對(duì)照品，依照上述1.2和1.3實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)方法，測(cè)定對(duì)照品與苯甲酸特征峰的峰面積，按照1.3公式計(jì)算，可得人參皂苷Rd對(duì)照品的絕對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，同時(shí)采用高效液相峰面積歸一化法測(cè)定其相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。測(cè)定結(jié)果如表2所示。從表2數(shù)據(jù)對(duì)比可看出，HPLC法測(cè)定得到的人參皂苷Rd的質(zhì)量分?jǐn)?shù)略高于氫核磁定量法，主要是由于人參皂苷Rd對(duì)照品中殘留溶劑及殘留水分無(wú)色譜響應(yīng)，而氫核磁定量技術(shù)測(cè)定時(shí)去除了人參皂苷Rd所含溶劑及水分，只測(cè)定了絕對(duì)含量。

表2 3批人參皂苷Rd對(duì)照品含量測(cè)定結(jié)果(質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%)Table 2 Determination result for the control content of ginsenoside Rd

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用氫核磁定量技術(shù)對(duì)人參皂苷Rd含量進(jìn)行測(cè)定，線性關(guān)系、精密度和穩(wěn)定性均良好。氫核磁定量技術(shù)不依賴色譜分離，基于質(zhì)子的響應(yīng)而實(shí)現(xiàn)定量，信號(hào)無(wú)選擇性響應(yīng)。定量核磁技術(shù)相比于經(jīng)典的高效液相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用、液質(zhì)聯(lián)用等方法，不依賴于被測(cè)物的高純標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量分析，不需要繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[16]。此外，該方法同時(shí)可體現(xiàn)提取物結(jié)構(gòu)信息，可在定量同時(shí)具有一定定性特征。然而定量核磁技術(shù)也存在著自身的局限性，使用定量核磁則待測(cè)物中須有分離度較好信號(hào)，若圖譜信號(hào)重疊，則限制了該方法的應(yīng)用。隨著核磁共振技術(shù)的不斷發(fā)展，氫核磁定量技術(shù)在定量分析中也需要進(jìn)一步研究和發(fā)展。