譚人千， 張 智▲， 寧海恩， 張麗敏， 王 遠(yuǎn)， 凌江紅, 2△

(1廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院， 廣西 南寧 530021；2上海市浦東新區(qū)周浦醫(yī)院， 上海 200120)

大量研究表明[1]，胃腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cells of Cajal，ICCs)作為胃腸活動的起搏者和調(diào)節(jié)者廣泛分布于胃腸道，并作為胃腸道內(nèi)神經(jīng)傳遞的中介，參與神經(jīng)興奮的傳遞。ICCs的增殖、分化以及數(shù)量和結(jié)構(gòu)的改變，可導(dǎo)致胃腸動力障礙性疾病，如功能性消化不良、胃輕癱、假性腸梗阻和胃食管反流病等。自噬是機(jī)體內(nèi)一種保護(hù)性機(jī)制，在應(yīng)激狀態(tài)下可將損傷的細(xì)胞器和細(xì)胞進(jìn)行清理，維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)。當(dāng)細(xì)胞自噬過度時(shí)可啟動細(xì)胞程序性死亡，從而導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量的減少，因此從自噬方面研究ICCs對理解胃腸動力障礙性疾病的機(jī)制有重要意義。本課題組前期動物實(shí)驗(yàn)已證明ICCs自噬可導(dǎo)致功能性消化不良[2-3]，因此構(gòu)建ICCs自噬模型為進(jìn)一步研究胃腸動力障礙的機(jī)制提供細(xì)胞模型基礎(chǔ)。目前，谷氨酸的興奮性毒性已得到證明，并且已有谷氨酸誘導(dǎo)神經(jīng)元自噬損傷的模型[4],但尚缺乏構(gòu)建ICCs自噬的模型。為此，本研究用谷氨酸對胃ICCs進(jìn)行干預(yù)，通過CCK-8法檢測細(xì)胞活力，透射電鏡檢測自噬體和超微結(jié)構(gòu)的變化，Western blot和免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測自噬標(biāo)志蛋白LC3的表達(dá)，進(jìn)一步探討ICCs自噬模型的建立。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級SD大鼠30只，雌雄不限，體重200 g左右，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號為SCXK(桂)2014-0002。

2 主要試劑

M199培養(yǎng)基(HyClone)；胎牛血清(Gibco)；Ⅱ型膠原酶、大鼠干細(xì)胞因子(stem cell factor，SCF)和L-谷氨酸(Sigma)；胰蛋白酶、青-鏈霉素混懸液、D-Hanks緩沖液和抗熒光淬滅封片液(杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)； CCK-8試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒、Western blot的I抗稀釋液及DAPI溶液(即用型)(碧云天生物技術(shù)研究所)；抗兔IgG和兔抗鼠微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3)抗體(Novus)；兔抗大鼠c-Kit蛋白多克隆抗體(Pierce)； Dylight 488 Conjugated Goat anti-Rabbit IgG(聯(lián)科生物公司)；抗GAPDH抗體(SAB)；抗兔及抗小鼠熒光 II 抗(LI-COR Biosciences)。

3 方法

3.1原代培養(yǎng)大鼠胃ICCs 參照參考文獻(xiàn)[5-6]，取SD大鼠，雌雄不限, 禁食不禁水8 h，10%水合氯醛按3 mL/kg腹腔注射麻醉后無菌開腹取胃, 沿胃小彎剪開, 用D-Hanks緩沖液(含雙抗)清洗3遍, 在解剖顯微鏡下用銳性鑷子剝?nèi)ノ葛つ? 將胃肌條剪碎至0.1 cm×0.1 cm大小，加入Ⅱ型膠原酶消化液(用不含血清的M199培養(yǎng)基配制，終濃度1.3 g/L)于37 ℃恒溫水浴箱中消化胃組織碎塊50 min左右, 1 000 r/min、5 min離心棄上清，D-Hanks緩沖液重懸并吹打5 min, 再離心棄上清, M199完全培養(yǎng)基(含M199培養(yǎng)基、10%胎牛血清、1%雙抗、0.5 mg/L兩性霉素B和25 μg/L干細(xì)胞因子)重懸細(xì)胞并過200目篩網(wǎng), 加入等量的Ficoll 400密度梯度液，1 000 r/min 離心7 min, 最后調(diào)整細(xì)胞密度為1×109/L, 每個(gè)25 cm2的培養(yǎng)瓶接種4 mL，于37 ℃、CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h后換液, 沖去未貼壁的細(xì)胞, 此后每隔3 d換液1次。取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

3.2ICCs的免疫熒光鑒定 取對數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)冰凍甲醇固定10 min, 5%脫脂奶粉封閉10 min; 加入兔抗大鼠c-Kit蛋白多克隆抗體(1∶100)，4 ℃冰箱孵育過夜，PBST液沖洗3遍, 加入 II 抗(Dylight 488 Conjugated Goat anti-Rabbit IgG，1∶200)，37 ℃培養(yǎng)箱避光孵育1 h，PBST清洗3遍, 最后加抗淬滅封片液封片，置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

3.3CCK-8法檢測不同濃度谷氨酸對ICCs活力的影響 取對數(shù)生長期ICCs，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化并收集離心。重懸計(jì)數(shù)后接種于96孔板，每孔接種1×104的細(xì)胞量，24 h后換液并分別加入高、中和低濃度(分別為10 mmol/L、5 mmol/L和2.5 mmol/L)的谷氨酸，每組重復(fù)6孔，于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，分別加入10 μL CCK-8 孵育4 h后，酶標(biāo)儀以450 nm為檢測波長、630 nm為參比波長, 采用單步測量法測其吸度光(A)。

3.4Western blot檢測自噬標(biāo)志蛋白LC3的表達(dá)水平 取生長對數(shù)期ICCs, 經(jīng)胰酶消化離心后計(jì)數(shù)，并接種2×105個(gè)細(xì)胞至25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，貼壁24 h后，更換新的培養(yǎng)基, 并給予高、中和低濃度谷氨酸分別干預(yù)3 h、6 h和24 h后，經(jīng)預(yù)冷PBS洗滌3次，每次5 min，用微量移液器吸凈殘余PBS, 加入100 μL含1% PMSF的RIPA細(xì)胞裂解液，細(xì)胞刮子收集細(xì)胞及蛋白, 冰浴30 min,4 ℃、12 000 r/min離心20 min，吸取上清液, BCA法測量蛋白濃度，取100 μg蛋白與相應(yīng)量的上樣緩沖液混合，沸水變性5 min后放置冰上備用。蛋白經(jīng)12% SDS-PAGE分離膠和5% SDS-PAGE濃縮膠分離后轉(zhuǎn)移至0.45 μm的PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h，加入抗LC3 抗體(1∶1 000)及抗內(nèi)參照GAPDH抗體(1∶1 000) 4 ℃過夜，洗膜3次，每次5 min，加入遠(yuǎn)紅外熒光 II 抗(1∶10 000)，37 ℃孵育1 h，洗膜3次，每次5 min，最后使用Odyssey雙色紅外成像系統(tǒng)進(jìn)行掃膜成像, 通過Quantity One軟件對Western blot條帶進(jìn)行定量分析。

3.5透射電鏡檢測谷氨酸誘導(dǎo)后ICCs的自噬體和超微結(jié)構(gòu)的變化 取對數(shù)生長期的ICCs，經(jīng)胰酶消化離心后計(jì)數(shù)接種至6孔板中，每孔接種1×106的細(xì)胞量，貼壁24 h后，棄去孔內(nèi)舊培養(yǎng)基，加入中濃度谷氨酸與ICCs作用3 h后，經(jīng)預(yù)冷PBS洗滌3次，每次3 min。使用胰蛋白酶消化細(xì)胞并收集離心去上清，最后加入3%戊二醛、1%鋨酸雙重固定，丙酮逐級脫水及二甲酸二丙烯酯包埋，超薄切片處理，使用透射電鏡進(jìn)行觀察和攝圖。

3.6免疫熒光法檢測谷氨酸誘導(dǎo)后ICCs自噬蛋白LC3的表達(dá) 取對數(shù)生長期的ICCs，經(jīng)胰酶消化離心后計(jì)數(shù)，接種至含無菌圓形蓋玻片的24孔板中，每孔接種5×103個(gè)細(xì)胞，貼壁24 h后，加入中濃度谷氨酸與ICCs孵育3 h，棄去舊培養(yǎng)基，PBS清洗，用預(yù)冷的多聚甲醛固定10 min，PBST清洗3次,每次5 min，再加入5%脫脂奶粉封閉10 min，PBST清洗3次；將玻片置于染色盒內(nèi)，加入兔抗鼠LC3抗體(1∶100)，37 ℃孵育30 min。PBST清洗3次，加入 II 抗：FITC標(biāo)記羊抗兔抗體(1∶200)避光置于37 ℃孵育30 min。PBST清洗3次，再加入DAPI染液室溫孵育10 min，最后加抗熒光淬滅液封片，熒光顯微鏡下觀察LC3的表達(dá)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，兩組間均數(shù)比較采用Student’st檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 ICCs免疫熒光鑒定

免疫熒光染色對ICCs內(nèi)特異性c-Kit蛋白染色，可鑒定培養(yǎng)的原代ICCs。普通顯微鏡和熒光顯微鏡下ICCs特征明顯，胞體呈三角形、菱形，核大，核周胞質(zhì)較少，胞體可見2個(gè)以上長突起，相互連接并與周圍細(xì)胞緊密相連；熒光顯微鏡下c-Kit蛋白呈陽性表達(dá)，胞體明顯著色，呈綠色陽性顯色,見圖1。

2 不同濃度谷氨酸對ICCs活力的影響

與空白對照組相比，谷氨酸各濃度組所測得的A值均顯著降低(P<0.01)；此外，中、高濃度組所測得A值均顯著低于低濃度組(P<0.01)，而中濃度與高濃度組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖2。

Figure 1. Immunofluorescence identification of ICCs. A: morphology of ICCs under phase-contrast inverted microscope (×40); B～D: morphology of ICCs under fluorescence microscope (B:c-Kit immunostaining,×40; C: c-Kit immunostaining,×200; D: DAPI staining, ×200).

Figure 2. The viability of ICCs treated with glutamic acid. Mean±SD.n=6.##P<0.01vscontrol group；&P<0.05vslow dose group.

3 不同濃度的谷氨酸作用于ICCs不同時(shí)間后自噬蛋白LC3的表達(dá)

與空白對照組比較，中、高濃度谷氨酸分別干預(yù)不同時(shí)間均可顯著提高自噬蛋白LC3-II/LC3-I的比值(P<0.01)，其中以中濃度谷氨酸干預(yù)作用3 h的LC3-II/LC3-I比值最高(P<0.01)，隨著作用時(shí)間的增加，細(xì)胞自噬活性相對逐漸下降(P<0.01)，見圖3。

4 ICCs內(nèi)自噬體和超微結(jié)構(gòu)的變化

透射電鏡下，空白組ICCs內(nèi)可見豐富的線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器，未見明顯的自噬體或自噬溶酶體；谷氨酸中濃度3 h組可見明顯的自噬泡，自噬體內(nèi)可見未被完全消化的細(xì)胞器，并且細(xì)胞質(zhì)內(nèi)空泡增多，線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器數(shù)量明顯減少，見圖4。

Figure 3. The ratio of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ in the ICCs treated with glutamic acid at different concentrations for different periods. Mean±SD.n=3.#P<0.05,##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vshigh dose group；△△P<0.01vs24 h group；▲▲P<0.01vs6 h group.

5 ICCs內(nèi)自噬蛋白LC3熒光表達(dá)量的比較

正常細(xì)胞內(nèi)自噬蛋白LC3呈均勻性低水平表達(dá)；谷氨酸中濃度組的ICCs可見LC3的表達(dá)增強(qiáng)，并在胞漿中聚集呈斑點(diǎn)樣，LC3的平均熒光強(qiáng)度較空白組顯著增強(qiáng)(P<0.01),見圖5。

討 論

谷氨酸是維持機(jī)體正常生理功能、參與多種蛋白質(zhì)合成及神經(jīng)遞質(zhì)傳遞的重要氨基酸。谷氨酸在動物腦部含量最多，并作為興奮性氨基酸被認(rèn)識；而過量的谷氨酸由于其興奮毒性和氧化應(yīng)激的損傷可誘導(dǎo)神經(jīng)元自噬[7]。孟晶等[8]研究發(fā)現(xiàn)谷氨酸可損傷視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，隨著細(xì)胞外谷氨酸濃度增加，細(xì)胞膜上的谷氨酸受體被激活，進(jìn)而導(dǎo)致鈣離子內(nèi)流，不斷增加的鈣離子可激活鈣調(diào)蛋白依賴性激酶介導(dǎo)的自噬[9]。過量的谷氨酸導(dǎo)致正常細(xì)胞自噬性損傷，與機(jī)體在不良應(yīng)激時(shí)導(dǎo)致的損傷有相似之處。因此應(yīng)用谷氨酸可以更好地模擬外界不良應(yīng)激對ICCs產(chǎn)生的作用，從而誘導(dǎo)自噬。本實(shí)驗(yàn)以谷氨酸作用于體外培養(yǎng)的SD大鼠胃ICCs，CCK-8法檢測結(jié)果提示各濃度谷氨酸均可降低ICCs的活力，且中、高濃度組的細(xì)胞活力均顯著低于低濃度組。

自噬標(biāo)志蛋白LC3是目前為止在哺乳動物中被了解最透徹的一種自噬相關(guān)蛋白。在細(xì)胞中有2種存在形式，分別為LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ，前者位于胞漿內(nèi)，而后者位于自噬泡膜表面。在自噬體形成過程中，LC3-Ⅰ與自噬膜的磷脂以酰胺鍵進(jìn)行結(jié)合，形成LC3-Ⅱ參與自噬膜的合成。Sou等[10]研究顯示去除LC3-Ⅱ?qū)⒉荒苄纬赏暾]合的自噬體結(jié)構(gòu)，故LC3-Ⅱ?qū)τ谧允审w的形成十分必要。發(fā)生自噬時(shí)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值與自噬泡數(shù)量成正比，故常作為評估細(xì)胞自噬強(qiáng)弱的重要依據(jù)[11]。本實(shí)驗(yàn)用Western blot法檢測不同濃度、不同作用時(shí)間ICCs內(nèi)自噬蛋白LC3的表達(dá)，結(jié)果表明中濃度(5 mmol/L)谷氨酸作用3 h時(shí)ICCs自噬活性最強(qiáng)。為繼續(xù)驗(yàn)證谷氨酸在此濃度及時(shí)間下的作用效果，我們通過透射電鏡及免疫熒光觀察，顯示谷氨酸中濃度組較空白組出現(xiàn)了明顯的自噬泡，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)空泡增多，細(xì)胞器減少，并且自噬蛋白LC3熒光表達(dá)顯著增強(qiáng)，說明本實(shí)驗(yàn)成功誘導(dǎo)了ICC的自噬。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，中、高濃度谷氨酸作用3 h時(shí)自噬活性最強(qiáng)，而作用6 h和24 h時(shí)自噬活性相對逐漸下降，這可能與自噬保護(hù)作用有關(guān)，細(xì)胞發(fā)生應(yīng)激性反應(yīng)初期，由于細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量受損的亞細(xì)胞器、錯(cuò)誤折疊蛋白等，細(xì)胞自噬活性增加，通過自噬清除這些廢物[12]，而隨著時(shí)間延長，錯(cuò)誤折疊蛋白和細(xì)胞器被清除后，細(xì)胞逐漸恢復(fù)穩(wěn)態(tài)，細(xì)胞自噬的活性隨之而逐漸減弱。

Figure 4. The autophagosomes/autophagic vacuoles and ultrastructure of ICCs observed under transmission electron microscope (×30 000). ▲： initial autophagic vacuoles (AVi)； →： degrading autophagic vacuoles (AVd).

Figure 5. Observation of LC3 in the ICCs of each group under fluorescence microscope (×200). Mean±SD.n=20.##P<0.01vscontrol group.

總之，本實(shí)驗(yàn)證明了谷氨酸可以誘導(dǎo)大鼠胃ICCs的自噬，其最佳作用濃度和時(shí)間分別為5 mmol/L和3 h，為進(jìn)一步研究ICCs自噬的分子機(jī)制及相關(guān)藥物的研發(fā)提供了有效的細(xì)胞模型。