曾彩雨， 賀 紅， 楊發(fā)林， 潘 建， 寧建文， 劉 鑫

(1浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院急診科， 浙江 杭州 310003； 山東大學(xué)齊魯醫(yī)院2心內(nèi)科,3檢驗科， 山東 濟南 250012)

血管內(nèi)皮功能障礙尤其是內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)功能障礙參與動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)的發(fā)生發(fā)展，并在缺血性疾病中起重要作用，外周血和骨髓來源的EPCs在特定條件下能夠定向遷移到內(nèi)皮損傷部位，通過一系列內(nèi)皮修復(fù)機制改善內(nèi)皮功能障礙[1]。既往研究表明一氧化氮(nitric oxide，NO)調(diào)節(jié)的信號途徑參與了EPCs的動員、增殖、遷移、分化和黏附的各個過程[2]。硝酸甘油(nitroglycerin,NTG)作為治療心血管疾病的基礎(chǔ)藥物已有百年歷史，然而實驗證實給大鼠48 h不間斷滴注硝酸甘油能制作硝酸甘油耐藥模型，并發(fā)現(xiàn)硝酸甘油耐藥可誘導(dǎo)EPCs凋亡并抑制其增殖；臨床經(jīng)驗也顯示長期持續(xù)或一次大量靜脈應(yīng)用硝酸甘油會產(chǎn)生過量活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，細胞實驗證明這些ROS來自線粒體、NADPH氧化酶和脫耦聯(lián)的內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)等，其中損傷作用極強的過氧亞硝基陰離子(peroxynitrite anion，ONOO-)會降低NO的生物利用度，從而引起血管內(nèi)皮功能障礙，臨床上誘發(fā)硝酸甘油耐藥[3-4]。前期實驗已經(jīng)證明低濃度(7.5 mg/L)的硝酸甘油通過提供適宜濃度的外源性一氧化氮，可上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor-A，VEGF-A)的表達，促進EPCs的增殖；而高濃度(20.0 mg/L)的硝酸甘油通過過量外源性NO使ONOO-和ROS水平明顯增加，損傷細胞酶系統(tǒng)，從而降低NO的生物利用度，使EPCs增殖能力下降[5]。但是硝酸甘油影響EPCs增殖的分子機制尚未清楚，而β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol，β-ME)能否通過提供胞內(nèi)酶所需的巰基來減輕高濃度的硝酸甘油引起的耐藥也未可知。本研究以硝酸甘油作為研究對象，研究其對EPCs體外增殖影響的分子機制，并將β-巰基乙醇與中毒濃度的硝酸甘油聯(lián)用，探討硝酸甘油耐藥的干預(yù)措施及潛在機制，為硝酸甘油在冠心病(coronary heart disease, CHD)治療中的使用提供新的基礎(chǔ)理論依據(jù)，并為解決硝酸甘油耐藥問題提供新的思路。

材 料 和 方 法

1 患者來源

本實驗所選的冠心病患者為山東大學(xué)齊魯醫(yī)院2013年1月～2015年1月于心內(nèi)科住院患者，共75例，這些患者均因冠脈疾病行選擇性冠脈造影，經(jīng)相關(guān)檢查排除6個月內(nèi)曾患心肌梗死、主動脈狹窄、肥厚性心肌病及惡性高血壓，且住院期間未服用維生素E及維生素C等抗氧化的藥物。實驗分2組，其中對照(control)組40人，34例女性，6例男性，平均年齡(55.7±7.1)歲，住院期間未常規(guī)應(yīng)用硝酸酯類藥物或用藥小于24 h；硝酸甘油(NTG)組35人，31例女性，4例男性，平均年齡(58.9±8.0)歲，住院期間曾連續(xù)使用硝酸甘油(>0.5 μg·kg-1·min-1)超過48 h。本研究經(jīng)山東大學(xué)齊魯醫(yī)院倫理委員會通過(KYLL-2013-115)，所有患者及志愿者簽署知情同意書后獲取實驗材料。

2 實驗材料

胎牛血清、M199培養(yǎng)基、胰蛋白酶和PBS(Hyclone)；MTT (Sigma)；6孔、24孔及96孔細胞培養(yǎng)板(Corning)；VEGF及ONOO-酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(R&D system)；抗β-actin抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔/鼠 II 抗(中杉金橋)；鼠抗人p-Akt、Akt(Ser473)、p-eNOS和eNOS(Ser1177)抗體(CST)。CO2恒溫培養(yǎng)箱(HERAcell 2401)；酶標(biāo)儀(Infinite M200)；離心機(Beckman L-100XP)；倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS IX70-142)；激光共聚焦顯微鏡(ZEISS LSM710)。

3 實驗方法

3.1臨床試驗 留取上述患者及健康志愿者外周血各1 mL，用流式細胞儀測定CD34和KDR雙標(biāo)陽性的循環(huán)內(nèi)皮祖細胞水平，并用ELISA法檢測血漿中ONOO-和VEGF-A的表達水平。

3.2內(nèi)皮祖細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定 留取經(jīng)冠脈造影確診的冠心病患者及正常志愿者外周血各50 mL，用人淋巴細胞分離液經(jīng)密度梯度離心法獲得單個核細胞，加入M199培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度至(2～5)×109/L，接種至人纖維連接蛋白包被的24孔培養(yǎng)板中，放入培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2、濕度95%)中培養(yǎng)，培養(yǎng)4 d后去除未貼壁細胞，隔天換液。培養(yǎng)過程中在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。培養(yǎng)至第7天，對貼壁細胞進行鑒定：加入DiI標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍?DiI-labeled acetylated low-density lipoprotein,DiI-ac-LDL,2.4 mg/L)，37 ℃孵育1 h，PBS洗2次，4%多聚甲醛固定細胞，用PBS浸洗3次，晾干后將10 mg/L的FITC-UEA-I加入上述標(biāo)本，37 ℃孵育1 h，再用PBS洗3次，吹干待檢；滴上緩沖甘油(甘油1份和0.01 mmol/L、pH 7.2的PBS 1份)1滴，于多波長激光共聚焦顯微鏡鑒定。計數(shù)鑒定正常志愿者及冠心病患者貼壁細胞的數(shù)量，檢測其黏附能力、遷移能力(Boyden小室法)及成血管能力(采用體外血管生成試劑盒檢測體外EPCs的血管生成能力，細胞拉長變形，長度為寬度的4倍以上可被認(rèn)為形成小管)，以上計數(shù)均于400倍倒置顯微鏡下選取8個視野計數(shù)后，計算每高倍視野平均數(shù)。

3.3冠心病患者內(nèi)皮祖細胞活力的檢測 MTT法分別檢測硝酸甘油、LY294002及β-巰基乙醇對EPCs活力的影響，培養(yǎng)7 d后用胰蛋白酶消化貼壁的EPCs，并重新接種到96孔板中，分別用硝酸甘油(7.5和20 mg/L)、LY294002(50 μmol/L)及β-巰基乙醇(50 μmol/L)進行干預(yù)，72 h后用MTT法檢測EPCs活力，在培養(yǎng)第12天，在顯微鏡高倍視野下用人工計數(shù)法觀察不同濃度硝酸甘油對EPCs集落數(shù)及EPCs絕對計數(shù)的影響，在24孔板中培養(yǎng)可見集落時在400倍倒置顯微鏡下選取8個視野計數(shù)后，計算每高倍視野平均數(shù)，繼續(xù)培養(yǎng)2 d后消化下貼壁細胞計數(shù)絕對數(shù)取平均值，計數(shù)由未參與處理細胞的兩人獨立完成。

3.4冠心病患者EPCs培養(yǎng)液中ROS、ONOO-和VEGF-A水平的檢測 硝酸甘油和β-巰基乙醇干預(yù)72 h后，用DCFH-DA探針檢測上清液中ROS水平，去除細胞培養(yǎng)的上清液，每孔各加入10 μmol/L的DCFH-DA，并以DMSO作為溶劑對照，37 ℃孵育細胞60 min后，用PBS洗滌細胞2次，每孔再加入適量培養(yǎng)基，分別采用熒光顯微鏡及熒光酶標(biāo)儀對其熒光強度進行檢測；同時，根據(jù)ELISA試劑盒說明書用ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液中ONOO-及VEGF-A的水平。

3.5冠心病患者內(nèi)皮祖細胞Akt、p-Akt、eNOS及p-eNOS水平的檢測 用冷PBS漂洗細胞3次，每孔加入200 μL細胞裂解液，刮下細胞，冰上裂解30 min后，15 000 r/min、4 ℃離心30 min，取上清蛋白溶液于-70 ℃保存?zhèn)溆?，各組取30 μg蛋白進行SDS-PAGE，然后轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉-PBST室溫封閉1 h，分別加入I抗,4 ℃孵育過夜，PBST漂洗3次，每次10 min，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的II抗，37 ℃孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光顯影，用β-actin 蛋白的吸光度進行標(biāo)準(zhǔn)矯正，ImageJ計算目的蛋白磷酸化與β-actin的比值。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。所有實驗至少重復(fù)4次，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。表1和表2中兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，其余數(shù)據(jù)采用單因素方差分析比較組間差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 對照組與高濃度硝酸甘油組各項臨床資料及EPCs、VEGF-A和ONOO-水平

BMI: body mass index; SP: systolic pressure; DP: diastolic pressure; LDL-C: low-density lipoprotein cholesterol; ACEI: angiotensin-converting enzyme inhibitor; CCB: calcium channel blocker; EPCs: endothelial progenitor cells; VEGF-A: vascular endothelial growth factor-A; ONOO-: peroxynitrite; CRP: C-reactive protein.

表2 冠心病患者與健康志愿者循環(huán)血中內(nèi)皮祖細胞數(shù)量及功能的比較

結(jié) 果

1 冠心病患者臨床資料的比較

與對照組相比，在年齡、血壓、血糖和血脂等基礎(chǔ)資料無明顯差異的情況下，高濃度硝酸甘油組內(nèi)皮祖細胞數(shù)量明顯下降(P<0.01)，血清中ONOO-水平明顯升高(P<0.01)，VEGF-A水平顯著降低(P<0.01)，見表1。

2 冠心病患者EPCs功能變化及細胞形態(tài)觀察

與正常志愿者比較，顯微鏡高倍視野下觀察冠心病患者貼壁的EPCs數(shù)量減少(P<0.05)，黏附能力、遷移能力和成血管能力均減弱(P<0.05)，見表2；細胞形態(tài)的變化基本一致，培養(yǎng)7 d 的EPCs可見細胞集落周圍出現(xiàn)梭形細胞，見圖1A；培養(yǎng)14 d 的EPCs呈大的集落樣生長，四周梭形細胞放射狀排列，見圖1B；再培養(yǎng)1～2 d 呈鋪路石樣改變，見圖1C。2類人群來源的EPCs用DiI-ac-LDL和FITC-UEA-I鑒定，EPCs吸附FITC-UEA-I呈綠色，見圖1D，EPCs吸附DiI-ac-LDL呈紅色，見圖1E，合成后呈黃色，圖1F。

Figure 1. Morphology and characterization of EPCs from peripheral blood. A:colonies were reached a peak on the 7th d (×400); B: at day 14, the colony formation started with a central aggregate of round cells, surrounded by spindle-shaped cells radiating away from the central core that display endothelial features (×400); C: paving stone sample cells were formed (×400); D: the attached EPCs were evaluated for the uptake of lectin (FITC-UEA-I) (green,×100); E: binding of acetylated LDL labeled with 1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine (red,×100); F: the merged image of D and E(×100).

3 硝酸甘油影響冠心病患者EPCs活力的機制

與對照組相比，適宜濃度的硝酸甘油通過顯著增強EPCs中p-eNOS(Ser1177)和p-Akt(Ser473)的蛋白水平，見圖3C，改善PI3K/Akt/eNOS信號通路，從而促進VEGF-A分泌，見圖3B，來促進EPCs的生長，見圖3A；而高濃度硝酸甘油抑制了Akt和eNOS的磷酸化水平及VEGF-A的分泌，見圖3C、4D，提高了上清液中ONOO-水平及貼壁細胞ROS水平，見圖4B、圖2，使EPCs的活力被抑制，見圖3A、4A。

4 β-巰基乙醇明顯改善高濃度硝酸甘油對冠心病患者EPCs活力的抑制作用

Figure 2. The effect of NTG and β-ME on the releasing of ROS in EPCs. Mean±SD.n=5.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsNTG (20 mg/L) group.

Figure 3. The effects of NTG and LY294002 on the cell viability of EPCs. A and B: the cell viability and VEGF-A production of EPCs were detected; C: the protein expression of p-Akt and p-eNOS was detected by Western blot. Mean±SD.n=5.# P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsNTG (7.5 mg/L) group;△P<0.05vsNTG (20.0 mg/L) group.

Figure 4. The effects of NTG and β-ME on EPCs.A: pre-incubation with β-ME enhanced the proliferation of EPCs as compared with single NTG treatment (20.0 mg/L); B and C: there was a significant decrease in ONOO-production, and a significant increase in VEGF-A production between NTG-treated group and the NTG (20.0 mg/L)+β-ME (50 μmol/L) group;D:β-ME reversed the effect of excess NTG (20.0 mg/L)-induced down-regulation of p-Akt and p-eNOS protein levels. Mean±SD.n=3.#P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsNTG (20 mg/L) group.

與高濃度硝酸甘油(20.0 mg/L)組相比，聯(lián)用β-巰基乙醇明顯降低ONOO-的水平，見圖4B，和降低貼壁細胞ROS的生成，見圖2，改善磷酸化Akt和eNOS的水平，見圖4D，表明β-巰基乙醇可以通過減輕氧化應(yīng)激并改善PI3K/Akt/eNOS信號通路來改善硝酸甘油耐藥。

討 論

本研究證明了：(1)與對照組相比，連續(xù)應(yīng)用高濃度硝酸甘油48 h可使冠心病患者會產(chǎn)生耐藥，具體表現(xiàn)為抑制外周血中EPCs活力，使其分泌ONOO-水平升高血循環(huán)血中VEGF-A的分泌減少；(2)不同濃度硝酸甘油通過影響EPCs中p-Akt和p-eNOS的蛋白水平影響ONOO-和VEGF-A生成來改變EPCs的細胞活力；(3)β-巰基乙醇從蛋白水平改善了耐藥情況下EPCs中Akt和eNOS的磷酸化水平，恢復(fù)了eNOS的活性，改善了硝酸甘油耐藥，說明除了已證明的NO可通過環(huán)磷酸鳥苷通路介導(dǎo)影響細胞生長和分化，外源性NO也通過PI3K/Akt/eNOS信號通路介導(dǎo)影響細胞的生長和分化。

通過新生血管供給營養(yǎng)來恢復(fù)組織和器官的功能被認(rèn)為是機體發(fā)生缺血性疾病后自我修復(fù)的一種重要途徑，EPCs在缺血組織血管新生中起到關(guān)鍵作用[6]。以往研究證明PI3K/Akt/eNOS信號通路在細胞的生長、增殖及功能發(fā)揮等多方面具有重要作用[7]。該信號途徑的多種上游細胞因子(如PI3K及PKB/Akt)和下游因子(如eNOS、mTOR、p70S6K和FOXO)等調(diào)節(jié)EPCs的增殖[8-9]。在PI3K及eNOS敲除的小鼠中由缺血和VEGF引起的EPCs的增殖和動員能力均下降[10]。我們的研究也證明了適宜濃度的硝酸甘油可以通過提供的外源性NO來調(diào)節(jié)PI3K/Akt/eNOS信號通路，促進EPCs生長。

以往的研究大多認(rèn)為硝酸甘油只能迅速改善心臟病癥狀，不能改善預(yù)后，且長期連續(xù)或一次大劑量應(yīng)用后會產(chǎn)生耐藥，限制了其在臨床上的應(yīng)用，目前的治療指南中硝酸甘油未成為像β-受體阻滯劑及鈣通道阻滯劑治療心臟病的一線藥物。引起硝酸甘油耐藥的機制有多種，近來對硝酸甘油體外耐藥機制的研究如下：(1)巰基耗竭學(xué)說認(rèn)為硝酸甘油向NO的生物轉(zhuǎn)化過程中需要多種巰基酶的參與，持續(xù)應(yīng)用硝酸甘油會引起細胞內(nèi)巰基的逐漸消耗，導(dǎo)致NO生成逐漸減少，生物利用度下降[3]；(2)氧化應(yīng)激學(xué)說認(rèn)為長期持續(xù)應(yīng)用硝酸甘油在代謝過程中產(chǎn)生過氧化亞硝酸蓄積，對細胞DNA損傷作用強[11]。研究證實持續(xù)硝酸甘油治療時超氧陰離子的生成主要來源有黃嘌呤氧化酶、NADH/NADPH氧化酶[12]、線粒體及內(nèi)源性NOS(主要是eNOS脫耦聯(lián)引起)，大量的超氧化物可以使硝酸甘油向NO的轉(zhuǎn)化發(fā)生障礙，生物利用度下降。

為了防止耐藥的發(fā)生，最常應(yīng)用的策略是小劑量間斷應(yīng)用硝酸甘油，但會增加心臟缺血事件的發(fā)生率。本研究聯(lián)用β-巰基乙醇，表明：(1)由于硝酸甘油耐藥機制之一是巰基的耗竭，多種細胞在增殖、分化及發(fā)揮功能方面都有許多酶的參與，而這些酶中大多都含有巰基，既往研究表明β-巰基乙醇可通過提供巰基來改善細胞內(nèi)酶活力來促進其增殖，本實驗發(fā)現(xiàn)聯(lián)用β-巰基乙醇可改善硝酸甘油耐藥；(2)高強度的氧化應(yīng)激在硝酸甘油耐藥中作用明顯，本實驗證明β-巰基乙醇可以作為抗氧化劑，顯著減少高濃度硝酸甘油刺激時貼壁細胞的ROS產(chǎn)生量，ONOO-分泌量減少，顯著改善耐藥；(3)β-巰基乙醇從蛋白水平上改善了耐藥情況下EPCs中p-Akt和p-eNOS的蛋白水平，恢復(fù)了eNOS的活性。

總之，本研究從EPCs水平證明了適量濃度的硝酸甘油提供的外源性NO可以通過上調(diào)PI3K/Akt-eNOS信號通路使VEGF-A的含量增加，從而促進冠心病患者EPCs的細胞活力，聯(lián)用β-巰基乙醇可以改善硝酸甘油耐藥，從細胞水平上推測長期小劑量應(yīng)用硝酸酯類藥物或可以改善心臟病患者預(yù)后，從而擴大硝酸酯類的臨床適應(yīng)癥，為臨床上改善硝酸酯類耐藥提供了一種新思路。