尹樂樂, 葉莎莎， 歐陽東云， 曾耀英

(暨南大學1附屬第一醫(yī)院臨床檢驗中心，2生命科學技術學院組織移植與免疫研究中心， 廣東 廣州 510632)

紅景天苷(salidroside，Sal)是從傳統(tǒng)藏藥紅景天(Rhodiolarosea)根部提取出來的一種具有苯酚結構的化合物[1]。Sal作為傳統(tǒng)藏藥廣泛應用于抗炎[2]、抗氧化[3]和抗疲勞等方面的治療。有研究表明，Sal對多種細胞(如神經細胞、心肌細胞及內皮祖細胞[4]等)具有抗凋亡作用。在Sal對機體固有免疫細胞的影響方面，我們已在前期實驗中證實了Sal對小鼠腹腔巨噬細胞體外增殖、吞噬及NO產生均有促進作用，而對細胞凋亡和活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)產生均有抑制作用[5]。在Sal與T淋巴細胞研究方面，目前已有文獻表明，紅景天苷對某些動物模型體內T淋巴細胞型別轉換及相關細胞因子調節(jié)具有一定的作用[4-7]，但其對小鼠原代T淋巴細胞體外行為的影響卻鮮有報道。因此，我們通過分析Sal對小鼠T淋巴細胞體外活化、增殖、ROS產生及凋亡的影響，評價其免疫效應及作用機制。

材 料 和 方 法

1 動物

清潔級 BALB/c近交系雄性小鼠，3～4周齡及8～10 周齡，均購于廣東省醫(yī)學實驗動物中心，許可證號為SYXK(粵)2012-0122。 其中，3～4周齡清潔級 BALB/c近交系小鼠用于獲取胸腺T淋巴細胞，8～10周齡清潔級 BALB/c近交系小鼠用于獲取淋巴結T淋巴細胞。

2 主要試劑和儀器

紅景天苷購自中國江蘇華榮生物科技有限公司，粉末狀，水溶性，純度為99 %，將紅景天苷用PBS溶解配制成 400 mmol/L的儲存液，分裝，于-20 ℃避光保存，臨用前用 PBS稀釋成工作液；RPMI-1640 細胞培養(yǎng)液和胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自Gibco；大鼠抗小鼠CD3-PE和倉鼠抗小鼠CD69-FITC購自BD Pharmingen；羧基二乙酸熒光素琥珀酰亞胺酯(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFDA-SE)購自Molecular Probe；L-谷氨酰胺、β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol，β-ME)、刀豆蛋白 A(concanavalin A，Con A)、地塞米松(dexamethasone，DEX)、DMSO、MTT、2’,7’-二氯二氫熒光素二乙酸酯(2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate,H2DCFDA)及DiOC6(3)均購自Sigma。

手術剪、眼科剪和眼科鑷購自中國蘇州手術器械廠；細胞培養(yǎng)板、移液管、離心管、平皿和培養(yǎng)瓶均購自Corning;流式細胞儀(FACSCalibur)購自Becton Dickinson；酶標儀(680 型)購自Bio-Rad。

3 主要方法

3.1淋巴細胞懸液的制備 將BALB/c小鼠斷髓處死，浸泡于75%乙醇中進行消毒，無菌分離雙側腋窩、鎖骨下、腹股溝淺淋巴結和腸系膜淋巴結，置于盛有預冷的PBS的無菌平皿中，去掉被膜，研磨，200目尼龍網過濾。收集細胞，PBS離心(250×g, 4 ℃， 5 min)洗滌細胞2次，用RPMI-1640 完全培養(yǎng)液(含10% FBS、2 mmol/L L-谷氨酰胺、50 μmol/L β-ME、100 mg/L鏈霉素和1×105U/L青霉素)調成密度為3×109/L的淋巴細胞懸液。

3.2MTT比色法檢測Sal對小鼠T淋巴細胞活力的影響 實驗分組：陰性對照(negative)組、正常對照(control)組和單純藥物(Sal)組，每組設3個復孔。將密度為3×109/L的細胞懸液接種在96孔板中，每孔190 μL，加入10 μL終濃度分別為80 μmol/L、160 μmol/L和320 μmol/L的Sal工作液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。每孔加入20 μL MTT (5 mg/L)，避光孵育4 h后，離心(300×g，5 min)棄上清,每孔加100 μL DMSO，振蕩器上避光振蕩10 min，以溶解孔底紫色結晶，在酶標儀490 nm波長檢測各孔吸光度(A)值，并計算細胞的相對存活率，細胞相對存活率(%)=(Sal組A值-negative 組A值)/(control組A值-negative 組A值)×100%。

3.3熒光標記的單克隆抗體染色分析T淋巴細胞活化抗原CD69表達水平 實驗分組：control組、Con A組和Sal+Con A組，每組設3個復孔。Sal同T淋巴細胞孵育培養(yǎng)4 h后，加入終濃度為5 mg/L的Con A繼續(xù)作用8 h 后收集細胞。PBS離心(250×g，4 ℃，5 min)洗滌細胞2 次，重懸于PBS中，加入anti-mouse CD3-PE和anti-mouse CD69-FITC(終濃度為1 μg/106cells)，混勻后室溫避光染色30 min，PBS離心(250×g，4 ℃，5 min)洗滌細胞2次，立即上流式細胞儀檢測。

3.4CFDA-SE染色法檢測小鼠T淋巴細胞增殖情況 調整細胞密度為1×1010/L，加入CFDA-SE工作液(終濃度為1 μmol/L)，充分混勻，于室溫避光輕輕振蕩10 min。用等體積RPMI-1640培養(yǎng)液終止染色，離心(250×g，4 ℃，5 min)，棄上清，相同條件洗滌細胞2 次后，用RPMI-1640完全培養(yǎng)液重懸，并調整細胞密度為3×109/L。實驗分組：control組、Con A組和Sal+ Con A組，每組設3個復孔。Sal同T淋巴細胞孵育培養(yǎng)4 h后，加入終濃度為5 mg/L的Con A繼續(xù)作用72 h 后收集細胞，上流式細胞儀檢測。

3.5H2DCFDA熒光探針檢測小鼠T淋巴細胞胞內ROS的生成量 實驗分組：control組和單純藥物(Sal)組，每組設3個復孔。Sal同T淋巴細胞孵育培養(yǎng)48 h后，棄細胞培養(yǎng)板內上清液，再用板內PBS 清洗細胞后棄上清。用200 μL終濃度為5 μmol/L的H2CFDA將細胞重懸。將細胞懸液于室溫避光染色30 min，2 mL PBS離心(250×g，4 ℃，5 min)洗滌細胞2 次，棄去上清，用200 μL的PBS將細胞重懸，且立即上流式細胞儀檢測。

3.6DIOC6(3)染色檢測不同濃度Sal對T淋巴細胞線粒體活性的影響 實驗分組：control組和單純藥物(Sal)組，且每組設3個復孔。Sal同T淋巴細胞孵育培養(yǎng)48 h后，棄細胞培養(yǎng)板內上清液，再用板內PBS 清洗細胞后棄上清。用200 μL終濃度為20 nmol/L的DiOC6(3) 將細胞重懸。將細胞懸液于室溫避光染色30 min，加2 mL PBS離心(250×g，4 ℃，5 min)洗滌細胞2 次，棄去上清，用200 μL的PBS將細胞重懸，立即上流式細胞儀檢測。

3.7DiOC6(3)染色檢測DEX 誘導作用下Sal對T淋巴細胞線粒體膜電位的影響 實驗分組：control組、DEX組和Sal+DEX組，且每組設3個復孔。調整密度為3×109/L的細胞懸液，接種在96孔板中，每孔190 μL，加入10 μL Sal工作液，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中待藥物作用4 h后，加入1 μL濃度為100 μmol/L的地塞米松，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細胞，用2 mL PBS洗滌2 次(250×g，4 ℃，5 min)，棄去上清，用200 μL終濃度為20 nmol/L的DiOC6(3) 將細胞重懸。將細胞懸液于室溫避光染色30 min，PBS離心(250×g，4 ℃，5 min)洗滌細胞2 次，棄去上清，用200 μL的PBS將細胞重懸，立即上流式細胞儀檢測。

3.8小鼠胸腺T淋巴細胞懸液的制備 取3～4周齡BALB/c小鼠，斷頸處死，浸泡于75%乙醇中進行消毒，無菌分離胸腺組織，在含有PBS的無菌平皿中去掉被膜，于200目尼龍網研磨過濾，收集細胞，PBS離心(250×g，4 ℃，5 min)洗滌細胞2次。用含10% FBS的RPMI-1640完全培養(yǎng)液將胸腺細胞重懸，并調整細胞密度為3×109/L，即得胸腺細胞懸液。

3.9流式細胞術檢測Sal 對DEX誘導作用下胸腺T淋巴細胞凋亡的影響 實驗分組：control組、DEX組和Sal+DEX組，且每組設3個復孔。調整胸腺T淋巴細胞懸液接種于96 孔板，每孔190 μL體系。加入10 μL Sal工作液，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中待藥物作用4 h后，加入終濃度為10-7mol/L的DEX。于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，收集細胞，用PBS洗滌2 次(250×g，4 ℃，5 min)，棄去上清，用200 μL終濃度為20 nmol/L的DiOC6(3) 將細胞重懸。將細胞懸液于室溫避光染色30 min，PBS離心(250×g，4 ℃，5 min)洗滌細胞2 次，棄去上清，用200 μL 的PBS將細胞重懸，立即上流式細胞儀檢測。

3.10流式細胞術檢測及數據統(tǒng)計 全部數據經 FACSCalibur、FACSAria 型流式細胞儀和 CellQuest、FACSDivaTM軟件獲取，獲得的數據用CellQuest、 ModFit LT 3.2和FCS Express 3.0軟件進行分析。采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，數據以均數±標準差 (mean±SD)表示，組間均數比較則采用單因素方差分析(one-way ANOVA)結合Student-Newman-Keulsq檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 不同濃度Sal對小鼠T淋巴細胞體外細胞活力的影響

采用MTT法檢測Sal對小鼠T淋巴細胞存活的影響。結果顯示，終濃度分別為80、160及320 μmol/L的Sal同原代小鼠T淋巴細胞共孵育48 h后所得的細胞存活率都在90%以上，且與control組相比，無顯著差異，見表1。這一結果表明，實驗所選濃度范圍內Sal對小鼠T淋巴細胞活力的毒性影響較小。

表1 MTT法檢測不同濃度Sal對小鼠T淋巴細胞體外存活率的影響

2 Sal對Con A誘導作用下小鼠T淋巴細胞 CD69 分子表達水平的影響

小鼠淋巴結T細胞在靜息狀態(tài)下很少表達CD69；經單純Con A誘導T淋巴細胞8 h后， Con A組中表達 CD69 的 T淋巴細胞百分率顯著增加，與對照組相比較差異顯著(P<0.01)；實驗所用各濃度Sal均能升高 Con A 誘導的T細胞 CD69的表達水平，且呈一定的劑量依賴關系，其中，320 μmol/L Sal能明顯提高T淋巴細胞CD69的表達水平，與Con A相比較差異顯著(P<0.01)，見圖1、表2。

Figure 1. Effects of Sal on the expression of CD69 on activatited T lymphocytes in response to Con A stimulus.

表2 Sal對Con A刺激的T淋巴細胞CD69表達的影響

△△P<0.01vscontrol group；*P<0.05,**P<0.01vsCon A group.

3 Sal 對ConA 誘導作用下T淋巴細胞體外增殖的影響

CFDA-SE標記技術利用活細胞染料CFDA-SE隨細胞每增殖一代后，其熒光強度減半的原理，結合流式細胞術可動態(tài)追蹤分析淋巴細胞增殖。用ModFit LT 3.2軟件擬合后，我們計算得出各代細胞所占的百分率及增殖指數(proliferation index，PI)，即增殖后的細胞總數與增殖前的細胞總數的比值。CFDA-SE標記的T淋巴細胞經Con A誘導刺激72 h后增殖一次的代表性結果見圖2，正常對照組僅見一個親代峰，無增殖峰，未出現CFDA-SE熒光強度減弱；經Con A誘導刺激72 h后， Con A對照組的細胞出現4 個子代峰；而加入80、160及320 μmol/L的Sal后，各藥物組內細胞分裂的代數及PI值均有增長(P<0.01)，見表3。

4 Sal 對小鼠T淋巴細胞胞內ROS產生的影響

H2DCFDA 作為一種活細胞染料，它在進入活細胞膜內能夠被細胞內酯酶作用并轉化生成為H2DCF，而后者對細胞內各類ROS敏感且極容易被其氧化并生成2’，7’-dichloroflurorescein，該產物具有強熒光特性，通常結合熒光顯微鏡或流式細胞術檢測細胞內ROS水平，根據平均熒光強度(mean fluorescence intensity，MFI)的變化來表示細胞內ROS生成量的改變。結果顯示，各濃度Sal與T淋巴細胞共孵育作用48 h后均能顯著降低T淋巴細胞胞內ROS 的產量，其MFI值與control組相比顯著降低 (P<0.05)，見圖3。

5 不同濃度Sal對T淋巴細胞線粒體活性的影響

DiOC6(3)是一種親脂性熒光染料，它能夠與活細胞線粒體發(fā)生結合，其結合過程依賴于線粒體自身的膜電位水平,線粒體膜電位的變化又反映線粒體的自身活性，即線粒體膜穩(wěn)定性所處的狀態(tài)。一旦線粒體膜穩(wěn)定性變差，即線粒體膜通透性增高致使細胞趨向發(fā)生凋亡。通常在流式細胞術結果中DiOC6(3)的MFI發(fā)生左移往往是意味著細胞線粒體膜穩(wěn)定性變差。本次實驗結果顯示，單獨Sal作用于T淋巴細胞均能夠明顯提高其線粒體膜電位水平，且與control組相比較差異顯著(P<0.01)，且呈一定劑量依賴關系，見圖4。

Figure 2. Effects of Sal on the proliferation of T cells stimulated by Con A for 72 h.

表3 Sal對Con A誘導72 h條件下T淋巴細胞體外增殖的影響

Parent: parent cells; G: the cells at different generations; PI: proliferation index.**P<0.01vsCon A group.

6 Sal對DEX誘導作用下小鼠 T淋巴細胞線粒體膜電位的影響

我們分別用終濃度為80 μmol/L、160 μmol/L和320 μmol/L的Sal與T淋巴細胞共孵育4 h，然后再用DEX體外誘導T淋巴細胞24 h，結果顯示，DEX組DiOC6(3)的MFI值與control組相比顯著降低(P<0.01);各濃度Sal在DEX誘導條件下能顯著提升T淋巴細胞內線粒體膜電位水平(P<0.01),見圖5。

7 Sal 對DEX誘導作用下小鼠胸腺T淋巴細胞凋亡的影響

結果顯示，control組內胸腺T淋巴細胞發(fā)生凋亡率為(19.36±1.91)%，而經DEX誘導后，胸腺T淋巴細胞的凋亡比率上升至(35.48±2.13)%，與control組相比顯著升高(P<0.01);終濃度為80 μmol/L、160 μmol/L和 320 μmol/L的Sal均可以明顯降低DEX誘導的胸腺T淋巴細胞凋亡，其細胞凋亡率分別為(31.34±3.57)%、(28.99±2.54)%和(24.47±2.03)%(P<0.01)，見圖6。

討 論

T淋巴細胞源自機體骨髓中的淋巴樣前祖細胞，它在胸腺中發(fā)育成熟，并具有高度的異質性。它介導特異性免疫應答，在T細胞依賴性抗原誘導的體液免疫應答中發(fā)揮重要作用。我們知道，T淋巴細胞在執(zhí)行特異性免疫應答過程中，可分為3個階段：(1)T淋巴細胞特異性識別抗原階段；(2)T淋巴細胞活化、增殖和分化階段；(3)效應T淋巴細胞的產生和效應階段。幾乎所有免疫相關病癥的發(fā)生、發(fā)展均與T淋巴細胞行為的改變相關。而T淋巴細胞行為改變的程度又可直接影響著特異性免疫應答的模式、強弱和結果。例如，在機體感染病原微生物過程中，T淋巴細胞在識別特異性抗原后能否發(fā)生快速細胞活化和增殖這一事件是影響機體免疫系統(tǒng)對外界抗原進行免疫防御和免疫應答功能的關鍵環(huán)節(jié)。另外，T淋巴細胞的自身活性又是影響T淋巴細胞發(fā)揮功能的基礎。當T淋巴細胞因過度活化而發(fā)生大量凋亡時，通常會引起機體對外界病原微生物等抗原物質進行特異性免疫應答反應的能力下降。因此，保護機體T淋巴細胞行為對增強機體對特異性抗原的應答能力以及預防和控制相關感染性疾病的發(fā)生具有重要意義。

Figure 3. Effects of Sal on the production of ROS from T-lymphocytes. Mean±SD．n=3．△P<0.05,△△P<0.01vscontrol group.

Figure 4. Effects of Sal on the mitochondrial activity in T-lymphocytes. Mean±SD．n=3．△△P<0.01vscontrol group.

Figure 5. Effects of Sal on the mitochondrial membrane potential of T-lymphocytes stimulated by DEX. Mean±SD．n=3.△△P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsDEX group.

紅景天苷是從傳統(tǒng)藏藥紅景天根部提取出來的一種具有苯酚化學結構的化合物[1],它作為傳統(tǒng)藏藥廣泛應用于抗炎[2]、抗氧化[3]和抗疲勞等方面的治療。我們已在前期實驗中證實了Sal對小鼠腹腔巨噬細胞體外增殖、凋亡、吞噬、ROS和 NO產生等方面均有一定作用[5]。而在Sal與T淋巴細胞研究方面，目前已有文獻表明，Sal對某些動物模型體內T淋巴細胞型別轉換及相關細胞因子調節(jié)具有一定的作用[4-7]，但Sal對小鼠原代T淋巴細胞體外行為的影響卻鮮有報道。因此，我們通過分析Sal小鼠T淋巴細胞體外活化、增殖、ROS及凋亡的影響，評價其可能的免疫效應及作用機制。

Figure 6. Effects of Sal on apoptosis of thymus T cells in response to DEX. Mean±SD．n=3.△△P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsDEX group.

Con A是一種重要的多克隆刺激劑，其作用于T淋巴細胞表面的TCR/CD3復合體而誘導T淋巴細胞的活化及增殖?；罨腡淋巴細胞表面表達早期活化表面分子CD69，它是T淋巴細胞活化后最早表達的表面分子，在多克隆刺激劑Con A作用下，T淋巴細胞會迅速活化，即T淋巴細胞經ConA刺激后30～60 min即可檢到CD69 mRNA，2～3 h表達于T淋巴細胞表面，18～24 h表達量達到高峰。以CD69的表達水平作為T淋巴細胞的早期活化標志來研究體外干預對T淋巴細胞活化的影響是重要的免疫學研究方法。本實驗結果表明，通過對小鼠T淋巴細胞表面分子CD69表達百分率變化的檢測，Sal能夠促進Con A刺激下T淋巴細胞表面分子CD69的表達。這為Sal促進T淋巴細胞早期活化提供了直接證據，并可能對細胞活化后的細胞增殖等行為的影響提供實驗依據。

初始T淋巴細胞在病原微生物或免疫刺激原刺激下迅速活化，被活化的T淋巴細胞迅速進入細胞周期，并通過有絲分裂大量增殖，并進一步分化成為效應T 淋巴細胞并快速增殖，然后離開淋巴器官隨血液循環(huán)到達特異性抗原聚集部分執(zhí)行其免疫效應功能。因此本研究中，我們選用CFDA-SE染色結合流式細胞術檢測Sal對Con A刺激下小鼠T淋巴細胞增殖的影響。實驗結果表明，Sal 對 Con A 誘導的細胞增殖有明顯的促進作用，可顯著增加細胞的增殖指數及子代細胞所占的比例，并且呈劑量依賴性。謝樂斯等[8]研究表明，Sal具有類絲裂原樣效應，可增強T淋巴細胞介導的特異性免疫。這與我們結果相一致。但Sal對促進小鼠T 淋巴細胞增殖的機制尚未有研究表明，還有待進一步探討。

ROS能夠起始細胞的凋亡級聯反應。當細胞產生過量ROS往往導致細胞發(fā)生凋亡或壞死[9]。而細胞凋亡是一個主動的由基因決定的自動結束生命的過程。本研究分別以H2DCFDA染色法和DiOC6(3)染色結合流式細胞術分析Sal 對 T 細胞ROS產生和對細胞胞內線粒體膜電位的影響。結果表明，Sal的長時間作用能夠使T淋巴細胞內ROS的產量降低。同時，Sal亦能夠通過加強線粒體膜的穩(wěn)定性來抑制 DEX誘導T淋巴和胸腺細胞的凋亡。前人研究表明，Sal能清除機體內不同種類的超氧陰離子自由基和羥基自由基[10-11]。本研究結果與文獻研究結果相一致，但Sal在抑制T淋巴細胞胞內ROS產生以及保護細胞凋亡方面中所參與的環(huán)節(jié)尚未清楚，還需進一步工作加以證實。

綜上所述，Sal能夠明顯提高小鼠T淋巴細胞的活性，促進T淋巴細胞的體外活化和增殖，抑制細胞內ROS的產生以及DEX誘導的T淋巴細胞和胸腺細胞的凋亡。但Sal在抑制T淋巴細胞胞內ROS產生及保護細胞免于凋亡方面所參與的環(huán)節(jié)尚未清楚，還需我們進一步工作加以證實。