王學(xué)惠， 朱秀英， 貴英英， 趙國安△

(1新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科， 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院心血管病診療中心，2新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院急診科， 河南 衛(wèi)輝 453100)

心臟重構(gòu)伴隨慢性心力衰竭的發(fā)生發(fā)展，是心力衰竭(簡稱心衰；heart failure,HF)發(fā)生發(fā)展的核心機制，包括心肌細(xì)胞的肥大和間質(zhì)的纖維化[1]。心肌纖維化是指心肌正常組織中膠原纖維過量聚積和膠原成分發(fā)生改變，是心室重構(gòu)的重要表現(xiàn)形式之一[2]。研究表明神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1β(neuregulin-1β，NRG-1β)在心臟中有多種生物學(xué)的功效，包括促進(jìn)心肌細(xì)胞存活、生長、分化和增殖，抗凋亡，維持肌原纖維的結(jié)構(gòu)，抗衡腎上腺素能的作用，促進(jìn)血管再生，用于治療多種誘因?qū)е碌男牧λソ遊3-5]。近年來也有研究表明，NRG-1β改善心功能機制之一是抑制心肌纖維化[6]。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑是治療心衰的基石，通過抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)激活，抗凋亡，抑制心肌纖維化，從而逆轉(zhuǎn)左室重構(gòu)[7]，卡托普利(captopril，CAP)是其代表性的藥物。NRG-1β聯(lián)合卡托普利治療心衰是否能加強抗心衰的效應(yīng)，進(jìn)一步改善預(yù)后及其機制目前尚不明確。本研究以容量超負(fù)荷心衰大鼠為模型，通過外源性給予NRG-1β 及卡托普利在體干預(yù)，觀察比較兩者對大鼠心功能及心肌纖維化的影響，探討兩者聯(lián)合治療的作用及機制。

材 料 和 方 法

1 材料

NRG-1β購于ProSpec-Tany TechnoGene；卡托普利由Bristol-Myers Squibb 惠贈；[125I]血管緊張素II放射免疫檢測藥盒購于北京北方生物技術(shù)研究所；兔抗鼠轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)多克隆抗體、兔抗鼠α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)多克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG 購于Santa Cruz。

2 實驗動物模型建立及分組

清潔級青年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重160～180 g，購于西安交通大學(xué)實驗動物中心，動物合格證號為SCXK2007-001，均予正常飲食、自由飲水。50只大鼠隨機分成5組：假手術(shù)組(sham 組)、心衰組(HF組)、NRG組、卡托普利組(CAP 組)和聯(lián)合用藥組(NRG+CAP 組)，每組10 只。采用腹主動脈-下腔靜脈穿刺造瘺(aortocasval fistula，ACF)手術(shù)制作大鼠慢性心力衰竭動物模型，參照Garcia等[8]的方法并做改進(jìn)。Sham組只穿刺不造瘺；NRG組ACF術(shù)后8 周，大鼠尾靜脈注射NRG-1β (10 μg·kg-1·d-1)，連續(xù)7 d，之后繼續(xù)飼養(yǎng)至12 周；CAP 組ACF 術(shù)后第2 天開始給予卡托普利灌胃(13.5 mg·kg-1·d-1)，8周后經(jīng)大鼠尾靜脈注射同等量的生理鹽水，連續(xù)7 d，之后繼續(xù)飼養(yǎng)至12周;NRG+CAP組ACF術(shù)后第2天開始給予卡托普利灌胃(13.5 mg·kg-1·d-1)，8 周后經(jīng)大鼠尾靜脈注射NRG-1β(10 μg·kg-1·d-1)，連續(xù)7 d，之后繼續(xù)飼養(yǎng)至12 周。

3 方法

3.1超聲心動圖測定心臟大小和心功能 水合氯醛(300 mg/kg) 腹腔內(nèi)注射麻醉。大鼠仰臥位，將其四肢固定于木板上，剃凈胸部毛，使用Philips Sonos 5500多功能超聲診斷儀，經(jīng)胸超聲探頭頻率為2.5～3.5 MHz，測量左室舒張末期內(nèi)徑(left ventrieular end-diastolic diameter,LVEDD)、左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-stolic diameter,LVESD)、左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction, LVEF)和左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening, LVFS)等指標(biāo)。

3.2Masson染色檢測膠原的含量 左室心肌組織常規(guī)行石蠟包埋，組織切片，片厚5 μm，行Masson三色染色法觀察心肌纖維化的程度。顯微鏡下觀察Masson染色切片，膠原纖維呈藍(lán)色，肌纖維呈紅色。左室心肌間質(zhì)纖維沉積的評價：每組動物取5張切片，每張切片取5個高倍視野，用Image Pro-Plus 6.0圖像分析軟件分析，計算出膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction，CVF)，即膠原纖維面積占整個心肌組織面積的百分比，取測量的平均值比較。

3.3血漿中血管緊張素II(angiotensin II,Ang II)的測定 麻醉同前。從大鼠的腹主動脈抽出血液約2 mL，注入到特殊的酶抑制劑管中，充分混勻后即刻放入4 ℃冰箱中靜置1～2 h，取出后2 500 r/min離心7 min分離血漿，吸取上清液保存于EP管。利用放射免疫計數(shù)器測量各組樣品放射強度并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后分別計算出Ang II的含量。具體實驗步驟參照產(chǎn)品試劑盒說明書進(jìn)行。

3.4TGF-β1和α-SMA的定量檢測 取30 mg左右的左室心肌組織液氮研磨、RIPA裂解后用BCA法測蛋白濃度，根據(jù)所測得樣本蛋白濃度上樣，每孔蛋白上樣質(zhì)量50 μg，SDS-PAGE分離后，采用Western blot法將膠上蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至 PVDF 膜，5%脫脂奶粉室溫封閉 2 h 后，分別加入抗TGF-β1、α-SMA 和 GAPDH的抗體，4 ℃搖床孵育過夜，TBST溶液洗膜后加入 II 抗室溫孵育2 h，TBST洗膜后，加入ECL顯色，凝膠成像儀掃描拍照，用 UVIdoc 軟件進(jìn)行條帶灰度分析，以TGF-β1、α-SMA 與 GAPDH 條帶的積分吸光度(IA) 比值來評定2 種蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。

3.5心肌超微結(jié)構(gòu)的觀察 麻醉后立即開胸取出心臟，迅速取左心室前壁心肌，切成1 mm×1 mm×1 mm的大小塊狀，立即浸入2.5%的戊二醛復(fù)方固定液中，標(biāo)本送檢于西安交通大學(xué)電鏡實驗中心，使用日立H-7650型透射電子顯微鏡，觀察不同組別心肌組織的超微結(jié)構(gòu)。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件統(tǒng)計分析，計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用 SNK-q檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠超聲心動圖檢查結(jié)果

與sham組相比，HF組LVESD和LVEDD明顯增大，提示左室心腔擴大；LVEF和LVFS減小，提示左室收縮功能下降(P<0.05)。與HF組比較，NRG組、CAP組和NRG+CAP組的LVESD和LVEDD均明顯減小(P<0.05)，LVEF和LVFS明顯增加(P<0.05)，提示各治療組均能使左室心腔縮小，左室收縮功能明顯改善，逆轉(zhuǎn)左室重構(gòu)，且NRG+CAP組改善最明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. The echocardiographic indexes in various groups. Mean±SD.n=6.*P<0.05vssham group；#P<0.05vsHF group；△P<0.05vsNRG group;&P<0.05vsCAP group.

2 左室心肌組織Masson染色

Sham組心肌組織無膠原增生，HF組心肌組織間出現(xiàn)大量的膠原纖維增生，CVF顯著增高于假手術(shù)組(P<0.05)，各治療組的膠原纖維明顯減少，與HF組相比，CVF顯著降低(P<0.05)，且NRG+CAP組效果最明顯(P<0.05)，見圖2、表1。

3 各組大鼠血漿Ang II水平的比較

與Sham 組相比，HF 組大鼠的血漿Ang II水平明顯升高(P<0.05)；各治療組的血漿Ang II水平明顯降低，且NRG+CAP組效果最明顯(P<0.05)，見表1。

4 各組大鼠左室心肌組織超微結(jié)構(gòu)的觀察

Sham組的心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，肌原纖維排列整齊，肌節(jié)完整，Z線結(jié)構(gòu)清晰，線粒體嵴結(jié)構(gòu)清晰；HF組的心肌細(xì)胞腫脹，肌原纖維結(jié)構(gòu)松散，部分肌原纖維斷裂、溶解，排列紊亂，部分Z線消失，線粒體嵴減少，結(jié)構(gòu)不清晰，心肌細(xì)胞間可見大量膠原纖維；各治療組的心肌細(xì)胞腫脹減輕，肌原纖維結(jié)構(gòu)疏松，排列基本整齊，Z線結(jié)構(gòu)較清晰，線粒體略有增生，嵴較清晰，心肌細(xì)胞間可見膠原纖維輕度增生；NRG+CAP組效果最明顯，膠原纖維很少見，見圖3。

5 各組大鼠左室心肌組織TGF-β1和α-SMA表達(dá)水平的比較

HF組TGF-β1 表達(dá)水平較sham組明顯升高(P<0.05)，NRG組、CAP組和NRG+CAP組TGF-β1表達(dá)水平較模型組明顯降低，其中NRG+CAP組表達(dá)水平最低(P<0.05)。α-SMA在各組大鼠表達(dá)水平與TGF-β1趨勢相似,見圖4。

Figure 2. Masson staining of the left ventricular tissues in various groups (×200).

表1 各組大鼠左室心肌組織膠原容積分?jǐn)?shù)和Ang II濃度的比較

*P<0.05vssham group；#P<0.05vsHF group；△P<0.05vsNRG group;&P<0.05vsCAP group.

討 論

本實驗通過NRG-1β 與卡托普利單用及聯(lián)合應(yīng)用對慢性心力衰竭大鼠干預(yù)的結(jié)果顯示，與sham組比較，HF組大鼠LVESD和LVEDD明顯增加，提示左室心腔擴大，發(fā)生左室重構(gòu)；LVEF和LVFS減小，提示左室收縮功能下降；而與HF組相比，NRG、CAP組及NRG+CAP組大鼠LVESD和LVEDD明顯減小，提示左室心腔縮小，左室重構(gòu)明顯逆轉(zhuǎn)；LVEF和LVFS明顯增加，提示左室收縮功能明顯改善，其中NRG組與CAP組的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，并以NRG+CAP組改善最為明顯，說明NRG-1β的療效與卡托普利相似，而聯(lián)合用藥比單獨用藥能更好地改善心功能。

對各組大鼠左室心肌行Masson染色及超微結(jié)構(gòu)觀察，結(jié)果表明，與sham組相比，HF組大鼠左室心肌組織出現(xiàn)明顯心肌纖維化，CVF明顯升高；電鏡下，HF組心肌超微結(jié)構(gòu)明顯受損，可見大量膠原纖維增生。而與HF組相比，NRG、CAP組及NRG+CAP組大鼠左室心肌纖維化程度明顯減輕，超微結(jié)構(gòu)受損減輕，而NRG+CAP組改變最明顯，說明NRG-1β與卡托普利聯(lián)合應(yīng)用能進(jìn)一步抑制心肌纖維化，改善左室重構(gòu)。

TGF-β1是TGF-β多功能大家族的重要組成成員，是膠原纖維和其它細(xì)胞外因子合成和沉積的強有力促進(jìn)因子，與多種器官的纖維化密切相關(guān)[9]。研究證實，慢性心衰大鼠模型心肌組織中的TGF-β1表達(dá)明顯增強[10]；而α-SMA 作為心肌間質(zhì)細(xì)胞，其數(shù)量多，與心肌細(xì)胞最貼近，可抑制心肌細(xì)胞外基質(zhì)降解酶，促進(jìn)心肌纖維化，在心肌纖維化發(fā)展中起重要作用[11-13]。體外實驗也顯示，TGF-β1能促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)變成肌纖維細(xì)胞，促進(jìn)成纖維細(xì)胞中α-SMA 的表達(dá)，并產(chǎn)生大量的細(xì)胞外基質(zhì)，如膠原纖維和纖維黏連蛋白等[14]。心肌纖維化發(fā)生與TGF-β1 表達(dá)增高、Ang II的作用密切相關(guān)，Ang II可通過刺激TGF-β1及其Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而增加I、III型膠原和纖連蛋白的合成，并促進(jìn)心肌纖維化的發(fā)生[13，15]。本研究也表明，HF組大鼠血清Ang II濃度明顯升高，TGF-β1和α-SMA表達(dá)明顯增加，與文獻(xiàn)報道相符。

NRG-1及其ErbB受體形成的NRG-1/ErbB2信號系統(tǒng)參與心臟結(jié)構(gòu)形成、功能維持，心力衰竭時NRG-1/ErbB2信號系統(tǒng)受損，與心衰發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究認(rèn)為，心衰引起心肌纖維化的主要機制是RAAS的激活，而該系統(tǒng)中的關(guān)鍵活性成分為Ang II，促進(jìn)一系列生長因子TGF-β1 等分泌增加[16]。

Figure 3. Ultrastructure of the left ventricle in various groups (×10 000).

Figure 4. Protein expression of TGF-β1 and α-SMA in left ventricle in various groups. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssham group；#P<0.05vsHF group；△P<0.05vsNRG group;&P<0.05vsCAP group.

外源性NRG-1在體干預(yù)整體心衰動物能顯著改善心臟的收縮功能，已得到許多研究結(jié)果的證實，其中NRG-1能減輕心肌纖維化是其發(fā)生作用的主要機制之一。Li等[17]報道NRG-1明顯減輕糖尿病性心肌病的心肌纖維化，降低CVF，與NRG-1抑制RAAS激活、降低Ang II水平有關(guān)，NRG-1還可與TGF-β1競爭ErbB受體，延緩纖維化的發(fā)生。Galindo等[6]研究表明，NRG-1β能抑制TGF-β1誘導(dǎo)的Smad3磷酸化，減少大型心衰動物豬的心肌成纖維細(xì)胞生成，降低α-SMA表達(dá)水平。本研究結(jié)果也表明NRG-1β顯著降低NRG組大鼠血漿Ang II水平，降低TGF-β1、α-SMA表達(dá)水平，減輕心肌纖維化，與文獻(xiàn)報道相符。

RAAS抑制劑除了影響膠原纖維總量，還通過調(diào)節(jié)不同類型膠原的比例及網(wǎng)絡(luò)支架重構(gòu)來改善心肌纖維化[7， 11]。卡托普利是臨床最常用的的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑，能抑制RAAS激活，降低血漿Ang II水平，早已常規(guī)應(yīng)用于慢性心衰疾病的預(yù)防治療。大量的研究表明，抑制心肌纖維化，改善心室重構(gòu)是其治療心衰的主要機制之一[7]。本研究也發(fā)現(xiàn)，卡托普利能降低大鼠血漿Ang II水平，降低TGF-β1、α-SMA表達(dá)水平，減輕心肌纖維化。而其與NRG-1β 聯(lián)合應(yīng)用，作用疊加，降低血漿Ang II水平，抑制心肌纖維化作用明顯加強，心功能得到了進(jìn)一步的改善。本研究結(jié)果提示NRG-1β與卡托普利聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)一步降低血漿Ang II水平，抑制TGF-β1和α-SMA 的表達(dá)，可能是聯(lián)合用藥優(yōu)于單一用藥抗纖維化作用的分子機制之一。

綜上所述，該實驗證實了NRG-1β 與卡托普利抗心肌纖維化療效相似，以聯(lián)合用藥效果最佳，聯(lián)合用藥較單一用藥更能有效改善心功能，抑制心肌纖維化，延緩心力衰竭，為臨床治療慢性心衰的聯(lián)合用藥提供了實驗依據(jù)，其詳細(xì)分子機制需大量研究來闡明。